独活对痴呆大鼠脑中 p38MAPK信号转导通路的影响

张 杰 杜文彬

(辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)

阿尔茨海默病(AD)是发生在早老及老年期、不可逆转的、渐进性的、以精神行为异常为主的脑变性疾病,晚期可危及患者的生命,其发病率和死亡率逐年上升。AD的病理机制尚未明确。近年发现非甾类抗炎药对本病具有一定的治疗作用,进而使本病的免疫炎症假说得到关注。本病在中医属痴呆的一种,中医多认为以五脏虚损为本,湿痰瘀为标,研究以祛风胜湿药独活为本病治疗的切入点,采用非甾体抗炎药为对照,探讨独活在抑制 AD免疫炎性损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 β-淀粉样蛋白(1～40)的制备 Aβ1～40,瑞士巴亨公司,批号为 0710120,实验前 1 w以无菌生理盐水将 Aβ1-40稀释成2 g/L溶液,37℃温箱孵育 1w,使其变为凝聚态的 Aβ1～40。

1.2 模型复制 Wistar3.5月龄的雄性成年大鼠 30只,购于中国医科大学实验动物中心(合格证书 SCXK辽 2003-0009号),体重为(350±21)g。大鼠经腹腔注射 10%的水合氯醛(4 ml/kg体重)腹腔麻醉动物。大鼠麻醉成功后,将其固定于江湾 I型 C大鼠立体定位仪上,常规备皮消毒,切开皮肤,暴露前囟,参照包新民的《大鼠脑立体定位图》,在左右侧海马区(前囟后 3.0 cm,中线左右侧 2.0cm)用微型钻钻开颅骨,切开硬脑膜,用微量注射器自脑表面垂直进针 2.5 cm,缓慢注入凝聚态 Aβ1～401μl,留针 5 min,以使 Aβ充分弥散,然后缓慢撤针,缝合切口。假手术组注以等量生理盐水。术后 7 d,进行水迷宫测试。

1.3 动物分组与给药 手术前麻醉死亡 2只,1只手术过程中死亡(假手术组),均考虑麻醉死亡。将手术后 30只随机分为 4组,丹参组、独活组、西药组、模型组,每组 6只。假手术组注射生理盐水。依据等效剂量换算直接计算法,将成人临床用量换算为大鼠等效剂量,将上述药物配成独活组及丹参组每日分别以独活丹参以上述浓度灌胃,2 ml◦只-1◦d-1,西药组每日以吲哚美辛以上述浓度灌胃,2 ml◦只-1◦d-1,假手术组每日以生理盐水灌胃,2 ml◦只-1◦d-1,共 4 s。实验至第 28天始,进行药后空间学习记忆能力训练测试 3 d。

1.4 标本制备及p38 MAPK检测 取血后,除去大鼠颅盖,取出完整大脑组织,剥离海马组织。采用 Western印迹法检测海马组 p38 MAPK,采用 Flourchem V 2.0凝胶成像分析软件(A-merica)分析。

1.5 统计学方法 数据以x±s表示,组间比较,采用配对 t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1 独活对大鼠逃避潜伏期的影响 各组大鼠手术前逃避潜伏期无显著差异(P＞0.05);各组给药前(除假手术组)与手术前比较差异显著性(P＜0.05)。给药后除模型组、假手术组外,各组与给药前比较,逃避潜伏期均有缩短(P＜0.05),见表 1。

表1 大鼠手术前后逃避潜伏期(x±s,s)

2.2 独活对痴呆大鼠p38MAPK的影响 不同组别的大鼠海马组织内 p38 MAPK的表达有明显差异(P＜0.05),p38 MAPK的表达在模型组明显升高(0.944±0.110),而假手术组的表达在较低水平(0.454±0.081),独活组及西药组的 p38 MAPK表达较模型组有所降低(0.512±0.039,0.528±0.013),差异显著(P＜0.05),独活组、西药组 p38 MAPK表达水平较丹参组降低(0.808±0.020),但差别不显著(P＞0.05)。丹参组与模型组比较,p38 MAPK表达有所降低,但差别不显著(P＞0.05),见图 1。

图1 各组大鼠 p38MAPK表达

3 讨 论

促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。p38 MAPK是 MAPK家族的主要成员之一,参与了炎症、应激、细胞周期调控等病理生理过程〔1,2〕,其信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。p38 MAPK被磷酸化激活后,可以进一步激活其下游的激酶或多种转录因子,如蛋白激酶 MAPK APK 2、转录因子 ATF2、Erk 1等〔3〕,产生一系列细胞内效应,从而诱导一些特定基因的表达,包括诱导型一氧化氮合酶、选择素、肿瘤坏死因子 α(TNFα)、白细胞介素(IL)-1β等。活化的p 38 MAPK进入细胞核内使核转录因子磷酸化,从而调节基因转录,产生细胞因子,引起细胞增殖、分化、凋亡及细胞因子的合成,诱导 p38-caspase-3促凋亡通路。这些基因表达产物在脑神经细胞凋亡、炎性反应等过程中发挥着重要作用。另一方面,p38在 AD中主要以 2种途径发挥炎症相关作用:①作为炎性细胞因子的上游调控者,在细胞面对应激时活化,参与传导促炎信号,通过转录激活增加促炎细胞因子的合成,间接引发一系列病理效应;②p38还可作为炎性细胞因子的下游信号中继,介导促炎细胞因子的作用乃至炎症引发的有害效应,直接破坏 AD神经元。总之,p 38MAPK在AD病程中可能处于一个类似炎症过程的正反馈环内,只是由它介导产生效应的该种物质已不仅仅是炎症,而是 AD中神经元和非神经元的各类破坏和损伤〔4〕。

鉴于 p38 MAPK信号转导通路在Aβ引起的毒性反应中起着重要作用,探讨独活对调节MAPK信号转导通路的作用可能部分揭示独活在 AD治疗中的作用。本研究提示,独活可抑制Aβ大鼠脑中p38 MAPK的激活,一方面可抑制其对促炎信号的转导作用,也可以抑制其作为炎性细胞因子的下游信号中继而介导的炎症引发的有害效应,减轻小胶质细胞的引起的炎性反应;另一方面,可阻断 p38-caspase-3促凋亡通路,减少神经元细胞的凋亡。丹参组 p38 MAPK较模型组有所减低,但无统计学意义,提示活血化瘀方药丹参在抑制p 38 MAPK通路方面作用较弱,可能通过其他途径抑制细胞凋亡的发生,西药组 p38 MAPK较独活组有所下降,提示非甾类抗炎药物可能在抑制p 38 MAPK的活性方面要优于独活。

综上所述,当聚集的Aβ蛋白刺激小胶质细胞增生,产生一系列细胞毒性效应后,机体产生内源性炎症因子形成“级联效应”,可引起广泛的神经细胞损害。由于炎症因子及代谢产物数量众多,仅针对其中某一种或几种进行干预,往往达不到预期目的,因此通过阻断封闭炎症因子(如给予 IL-1Ra,TNF-R等)效果可能不十分理想。研究发现尽管炎症因子数量众多,但进入细胞内的信息通道却为数较少,如能对其中关键的信号通路进行有效阻断和调节,这对于调控炎症因子及应激蛋白的表达,具有目标明确,效果明显的优势。p38 MAPK通路是参与炎症反应调控的重要信号系统〔5〕。中药独活可抑制 p38 MAPK的活性,在信号通路水平阻断和调控 p38 MAPK的表达和活性,从而抑制AD脑中的慢性炎症反应,为中药防治阿尔茨海默病提供了一条新的治疗思路。

1 Irving EA,Barone FC,Reith AD,et al.Differential activation of MAPK/ERK and p38/MAPK in neurons and glia following focal cerebral ischemia in the rat〔J〕.Mol Brain Res,2004;77(1):65-75.

2 Legos JJ,Erhardt JA,White RF,et al.SB239063,a novel p38 inhibitor,attenuates early neuronal injury following ischemia〔J〕.Brain Res,2003;892(1):70-7.

3 Takagi Y,Nozaki K,Sugino T,et al.Phosphorylation of cJun NH2terminal kinase and p38 mitogen-activated protein kinase after transient forebrain is chemia in mice〔J〕.Neurosci Lett,2000;294(2):117-20.

4 刘海霞,何 建.p38MAPK的转导机制及相关疾病〔J〕.中国急救医学,2003;23(12):883.

5 Bu XN,Huang P,Qi ZF,et al.Call type-specific actiuation mice〔J〕.Neurochem Int,2007;51(4):459-66.