ADMA对人脐静脉内皮细胞粘附功能影响的体外研究

赵 雷,张吉凤,赵佳怡,祝金明,李淑梅*

(1.吉林大学第二医院心血管内科,吉林长春130041;2.吉林再生医学科学研究所;3.吉化总医院心血管内科)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是危害人类健康的最常见疾病之一,多项研究证实AS的始动及关键环节是内皮细胞的损伤。一氧化氮(NO)是内皮细胞合成的一种重要的血管活性物质,具有舒张血管,减弱氧自由基产生、低密度脂蛋白氧化等抗动脉粥样硬化(AS)的作用,NO合成障碍势必促进AS的发生、发展。不对称二甲基精氨酸(ADMA)是内源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂,通过影响NO合成而导致血管内皮功能障碍[1],因此与冠心病形成密切相关。本研究观察了ADMA对人脐静脉内皮细胞粘附的影响,旨在探讨其作为一个新的独立预测冠心病危险事件的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

ADMA标准品,纯度,99.99%(Sigma公司),M199培养基、胰蛋白酶(Gibico公司),胎牛血清(杭州四季青有限公司)、PE标记小鼠抗人ICAM-1抗体、APC标记小鼠抗人VCAM-1抗体(BD公司),NO检测试剂盒(南京聚力生物有限公司),其它为市售试剂。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养 用0.1% Ⅱ型胶原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞80%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 实验分组 将状态良好的用新鲜培养液培养24 h,再用0.25%胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液,以5×104/孔接种到24孔板中,对照组加含0.9%氯化钠培养液,ADMA组加分别含有5 μ mol/L和10 μ mol/L的培养液。每组设 5复孔,培养 48 h后进行数量和功能测定。

1.2.3 细胞粘附能力的测定 在倒置相差显微镜下随机挑选10个视野(x100倍)计数各组贴壁梭形细胞数后,用0.25%胰蛋白酶消化后制成单个细胞悬液,计数后等量接种到48孔培养板,5%CO2孵箱中培养2 h,洗去各孔未贴壁细胞,倒置相差显微镜下随机挑选10个视野(×100倍)计数各组重贴壁细胞数。

1.2.4 NO含量的测定 采用Griess重氮法反应测定细胞培养上清中NO的浓度。吸取各组每孔培养液100 μ l加入到96孔培养板中,再依次加Griess ReagentⅠ、Ⅱ,混匀,15分钟后用722分光光度计570 nm处测A值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞表面粘附分子的表达

分别取1×106各组HUVECs,用 PBS-2%FBS洗 1次,用100 μ l PBS-2%FBS制成单个细胞悬液。分别加入适量PE标记小鼠抗人ICAM-1抗体和APC标记小鼠抗人VCAM-1抗体,室温避光孵育15 min。各组细胞加入2.5 ml PBS-2%FBS,300 g离心10 min。重悬细胞在250 μ l PBS-2%FBS中于流式细胞仪测定。

1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS11.0软件进行统计学处理。计量资料用±s表示,各组之间的比较采用独立样本 t检验,P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADMA对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形态和数目的影响

对照组HUVECs在培养48 h后成梭形内皮细胞样,贴壁良好。ADMA不同剂量组细胞粘附能力明显降低,细胞形态亦发生改变(见图1)。与对照组相比,ADMA可明显降低贴壁细胞的数量,且成剂量依赖性(见表1)。

表1 ADMA对HUVECs粘附细胞数量的影响

2.2 ADMA对HUVECs培养上清中NO含量的影响

与对照组相比,ADMA可明显降低NO的生成(P＜0.01)。ADMA不同剂量组之间的差异亦有统计学意义(P＜0.05)(见图1)。

2.3 ADMA对HUVECs粘附分子表达的影响

流式细胞仪检测结果显示,ADMA可明显增强HUVECs细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达。与对照组相比,ADMA各剂量组ICAM-1和VCAM-1分子的表达量均有显著性差异(P＜0.01),ADMA不同剂量组VACM-1表达量的差异亦有统计学意义(P＜0.05)(见表2)。

图1 ADMA对细胞培养上清NO含量的影响

表2 ADMA对HUVECs粘附分子表达的影响(%)

3 讨论

动脉粥样硬化是一种多因素所致的动脉血管慢性疾病,集中表现为全身性血管内皮功能障碍、血管内膜慢性炎症、纤维增生、管腔狭窄及血栓形成等。近来研究表明,伴随以NO生物利用度降低为主要生化表现的血管内皮功能障碍是促使AS发生的始动因素。ADMA作为内源性NOS的抑制剂,通过减少NO合成导致内皮功能不全,因此ADMA与AS的发病密切相关[2-4]。Rainer等[5]证实高胆固醇血症家兔的血浆中ADMA浓度明显升高,而NO的含量明显降低。Cooke[6]等在对高胆固醇血症和动脉粥样硬化患者的血清检测中得到相似的结果。本研究结果证实不同剂量ADMA对HUVECs细胞产生的NO有明显抑制作用,且成剂量依赖性。同时,ADMA可明显降低HUVECs的数目和粘附性能,并对内皮细胞的形态有所改变。因此可以认为高水平的ADMA浓度是HUVECs功能受损的原因之一。

细胞粘附分子(CAM)是调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附及信号传到作用的糖蛋白,其如何参与心血管疾病的发生和发展一直是医学研究的热点问题[7,8]。有研究证明ICAM-1、VCAM-1是介导白细胞向血管内皮附壁游走和向内膜下浸润的主要分子之一,在AS形成过程中病变部位血管内皮二者的表达水平与病变的严重程度成正比[9]。CAM促进AS形成的机制与其增强循环血中单个核细胞粘附在血管内膜表面并迁移至血管壁,吞噬脂质形成斑块有关。本研究结果显示在ADMA的作用下,HUVECs细胞表面ICAM-1和VCAM-1的表达水平明显增高,提示促进粘附分子的表达可能为ADMA引发AS的机制之一。

AS是多种病因造成的始发于动脉壁内膜的一系列复杂分子和细胞改变的总结果,血管内皮细胞粘附特性的改变在参与AS发生发展的作用仍需从分子水平、基因调控等方面进一步研究阐明。

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