人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

许淑芬,刘 磊,孙牧男,赵 帅,方艳秋,谭 岩

(吉林大学第一医院中心实验室,吉林长春130021)

BNP是1988年日本学者Sudoh[1]最初由猪脑分离出来的一种32个氨基酸构成的多肽类神经激素,曾被命名为脑钠肽(brain natriuretic peptide),是心室分泌的激素样短肽,具有利尿利钠效应,能够舒张血管抑制醛固酮分泌及肾素活[2,3]。近年来由于发现血浆BNP水平在各种心血管疾病,尤其是心室功能不全、急性心肌梗死(AMI)、高血压等疾病的诊断、治疗及预后等方面有重要指导意义[4-7],引起临床工作者的高度重视,因此建立快速检测BNP的方法成了研究热点。本研究通过基因工程技术制备人BNP蛋白,为制备BNP的单克隆抗体、提供BNP测定的潜在质控物和实现BNP检测试剂国产化打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 大肠杆菌JM109、BL21、原核表达质粒pGEX-6P-1(本室保存),人心肌组织(吉林大学第一医院妇产科提供),pGEM-T easy载体(美国Promega公司),限制性核酸内切酶 BamH Ⅰ 、SalⅠ 、T4 DNA连接酶(TAKARA公司),Trizol(Ivit rogen公司),AMV逆转录酶(Promega公司),质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Vitagene公司),Glutathione Sepharose○R4B亲和层析柱(Qiagen公司),抗 B型钠尿肽单克隆抗体(北京晶美公司),生物素标记的马抗小鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的亲和素(北京鼎国生物公司)。

1.1.2 寡核苷酸引物设计与合成 遵循PCR引物设计的原则,根据GenBank(NM002521)的人B型钠尿肽cDNA序列,设计编码B型钠尿肽基因片段的5′和3′端寡核苷酸引物,并在各自 5′末端分别引入BamH Ⅰ和SalⅠ限制性酶切位点,在3′端引物的5′端引入了一个半胱氨酸。引物由大连宝生物工程公司合成 。P1:5′-ATGGATCCAGCCCCAAGATGGTG-3′;P2:5′-AAGACGTCTTAACAATGCCGCCTCAGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR扩增及测序 Trizol法从人心肌组织中提取总RNA,提取方法按照说明书进行,紫外分光光度计测RNA的A值并计算含量。cDNA的合成按说明书操作,并以此为模板PCR获得B型钠尿肽基因双链DNA。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收PCR产物,将纯化后PCR产物克隆至pGEM-T-easy载体,将构建的pGEM-BNP转化大肠杆菌高感受态细菌JM109,经过蓝白筛选,酶切、PCR鉴定初筛阳性克隆菌株,由大连宝生物工程公司测序。

1.2.2 重组表达载体的构建 将测序正确的重组克隆质粒pGEM-BNP和表达质粒pGEX-6P-1分别进行BamH Ⅰ、SalⅠ双酶切,凝胶回收,切取的BNP基因目的片段经T4 DNA连接酶插入pGEX-6P-1构建出重组表达质粒pGEX-6P-BNP,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经抗生素耐药性鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性克隆。

1.2.3 BNP阳性克隆菌株的诱导表达 阳性克隆菌接种于LB固体培养基(氨苄青霉素+、氯霉素+),挑选4个重组菌单菌落分别接种于2 ml LB液体培养基(含100 mg·L-1氨苄青霉素和50 mg·L-1氯霉素),37℃160 r·min-1振摇过夜,次日以1∶50 接种于2 ml LB液体培养基中,30℃230 r·min-1振荡培养至A600值0.4-0.6,加入IPTG至终浓度1.0 mmol·L-1,继续培养 5 h,4℃12 000 g 离心1 min,收集菌体,加入裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCL),12 000 g离心,分别取上清和沉淀加入等量的2×SDS变性缓冲液,SDS-PAGE电泳显示表达的BNP多数以沉淀的包涵体形式存在。

1.2.4 Western blotting印记分析 将电泳显示目的蛋白表达量较高的菌株沉淀行15%SDS-PAGE,用半干式转移电泳仪电转硝酸纤维素膜3 h,3%BSA封闭液4℃过夜,1×PBS洗膜,加入鼠抗人B型钠尿肽单抗(1∶1 000),37℃结合2 h,洗膜,加入马抗小鼠IgG(1∶1 000),37℃结合2 h,洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的亲和素(1∶1 000),37℃结合2 h,充分洗涤后DAB显色鉴定表达产物。

1.2.5 B型钠尿肽包涵体的提取及纯化 诱导200 ml阳性表达菌液,离心收集菌体沉淀,超声裂解菌体,离心得到的蛋白包涵体用变性裂解缓冲液重悬,4℃过夜变性至溶液清亮后经Glutathione Sepharose○R 4B亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳。

1.2.6 B型钠尿肽表达量测定 变性后的包涵体上清SDS-PAGE电泳图象经凝胶电泳图象分析仪扫描分析得到B型钠尿肽相对含量。

2 结果

2.1 人B型钠尿肽基因的克隆

RT-PCR扩增结果见图1。电泳结果显示,有与预期大小一致的DNA条带(约110 bP)。

2.2 重组表达质粒的构建及酶切鉴定

将人B型钠尿肽基因插入载体pGEX-6P-1,构建成重组质粒pGEX-6P-BNP,重组质粒经BamH 、SalⅠ双酶切后产生约110 bp大小的目的片段(图2)。

2.3 重组蛋白的表达筛选

将含重组表达质粒pGEX-6P-BNP的大肠杆菌BL21经1 mmol·L-1IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示表达一条相对分子质量约为29 KD的蛋白(图3)。动力学实验表明5 h表达量最高。

2.4 Western blotting印记分析

为证实表达蛋白的生物学特性,用鼠抗人B型钠尿肽单克隆抗体为一抗进行Western blot印记分析,在29 KD处呈现强特异性显色反应(图4)。

2.5 Glutathione Sepharose○R4B亲和层析柱纯化目的蛋白

SDS-PAGE结果显示电泳纯(图4)。

3 讨论

图1 BNP成熟肽cDNA扩增结果

图2 重组质粒pGEX-6PBNP的PCR及酶切鉴定

图3 在大肠杆菌中诱导表达BNP的SDS-PAGE分析

图4 BNP蛋白的亲合纯化和Western blotting印记分析

人体血浆中BNP的主要形式是含有特异性环状结构的32肽,分子量约为3.2 KD,主要来源是心室,因而人们推测血浆中BNP是心室疾病的敏感且特异的标志物[8]。经过多年的研究,BNP在心力衰竭中的诊断价值得到了多数学者的肯定。现在认为人血浆BNP水平的测定能被用于心力衰竭的诊断、心力衰竭的预后判断、心力衰竭治疗的监控、评价左心室功能不良程度、提示心内压力、对急性冠心病的预后判断等[9]。检测BNP的方法有免疫放射分析IRMA、免疫荧光法等,IRMA法由于半衰期短、测定时间长不适合于心脏病的急性诊断和小样本检测,适合于回顾性分析。国内对BNP的研究主要在利用国外进口试剂进行BNP检测的临床应用。本研究旨在建立检测人血浆BNP的免疫学方法,使BNP检测试剂国产化、快速化。本项目根据GenBank(NM002521)人BNPDNA序列,采用RT-PCR技术从人心肌组织中获得BNPcDNA序列,并构建了GSTBNP融合蛋白的表达质粒,表达载体pGEX-6P-1是一种较为高效的蛋白表达载体,含有强启动子tac及Lac操纵基因、SD序列及lac阻遏蛋白基因等。此载体SD序列的下游是GST基因,GST基因下游和多克隆位点上游间有编码凝血酶识别位点的序列。本试验中,GST-BNP表达质粒经IPTG诱导表达后,融合蛋白以包含体表达为主,用亲和层析分离纯化,每升诱导菌可得500 mg融合蛋白,GST-BNP表达量高。DNA测序、融合蛋白的分子量分析、Western-blot证实了GST-BNP蛋白的正确性,在3′端引入的半胱氨酸对BNP的蛋白折叠没有影响。BNP分子量仅为3.2 KD,是半抗原,不能直接免疫动物制备抗体。本实验制备的GST-BNP融合蛋白很好的解决了这一问题,GST-BNP融合蛋白能直接免疫动物制备抗体。因此本实验制备的人BNP抗原既具有免疫原性又具有反应原性。由于GST与BNP之间存在凝血酶识别位点,所以容易把BNP从GST-BNP中分离,得到单一的BNP,可以作为竞争性或包被抗原用于酶免分析中,为进一步试剂开发打下基础。

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