阿昔洛韦葡萄糖注射液细菌内毒素检查方法研究

董林青，邱向东，黄登峰，许广振

（山东胜利股份有限公司生物工程部，山东济南 250101）

细菌内毒素检查法又称鲎试剂法,是一种利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝聚反应来检查药品中内毒素含量是否符合规定的方法。阿昔洛韦葡萄糖注射液是抗菌药与抗病毒药的化学药品，本文参照文献[1-3]报道的细菌内毒素检查法，探讨了阿昔洛韦葡萄糖注射液的内毒素检查的具体方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

鲎试剂（批号：20060427,λ 为 0.125 EU/ml，规格：0.10 ml/支，湛江安度斯生物有限公司；批号：200606040，λ为0.25 EU/ml，规格0.10 ml/支，福州新北生化工业有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号：2006-4，160 EU/支,中国药品生物制品检定所）；细菌内毒素检查用水（批号：20070518，规格：5 ml/支,湛江海洋生物制品厂）；阿昔洛韦葡萄糖注射液3批样品（批号：070901、070902、070903,国内某医药有限公司，规格：100 ml：阿昔洛韦0.1 g，葡萄糖5 g）。

1.2 试药

XW-80型旋涡混匀器 （上海医科大学仪器厂）；S648型恒温水浴锅（上海医疗厂）；吸管；凝集管（75 mm）；试管、吸耳球、封口膜、试管架；超净工作台[4]，试验所用玻璃器皿均经重铬酸钾洗液处理后再以250℃烘烤1 h，以去除外源性细菌内毒素[5]。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的建立

按细菌内毒素公式L=K/M（K为人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，K=5 EU/（kg·h），M 为每千克体重每小时最大供试品剂量），根据本品制剂用法与用量中规定,该药一次剂量为5 mg/kg，成人体重以60 kg计，即成人每日每次最大剂量为 300 mg，则 M=300 ml/60（kg·h），L=5.0/300/60=1.0 EU/ml，但考虑到药品使用安全性要求及一般大容量输液细菌内毒素限值要求，将本品的细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml为宜。

2.2 鲎试剂标示灵敏度的复核

按《中国药典》2005年版规定进行灵敏度复核，结果20060427 批灵敏度 λc＝0.171 EU/ml（λb＝0.125 EU/ml）；200606040 批灵敏度 λc＝0.25 EU/ml（λb＝0.25 EU/ml），均符合药典规定，可用于细菌内毒素的检查。

2.3 供试品干扰预试验[6]

根据供试品内毒素限值（L）为0.5 EU/ml,市售鲎试剂λ最低为0.03 EU/ml，计算出鲎试剂λ为0.25、0.06 EU/ml时的供试品稀释倍数MVD=L/λ,即8.33～16.67倍，则最小有效浓度为0.12~0.06 mg/ml。取3批供试品,用BET水将供试品分别稀释为 1.00、0.50、0.25 mg/ml，同时选择 λ=0.25 EU/ml的鲎试剂,将每个浓度供试品液均制备含有2.000 λ（0.5 EU/ml）及0.125 λ（0.06 EU/ml）的细菌内毒素作为供试品阳性液。每一浓度制备2支试管,同时设阴性对照、阳性对照，结果见表1。结果表明，供试品预试验为稀释后对以上两个厂家的鲎试剂均未产生干扰作用。

表1 干扰预试验

2.4 供试品干扰试验

根据预试验结果，用供试品原液及BET水分别将细菌内毒素工作标准品制成表2所示的一系列浓度，每一浓度的细菌内毒素标准溶液平行制备4支;另取细菌内毒素检查用水和此浓度的稀释液各制备2支阴性对照管。按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值Es,以及此浓度的稀释液制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值Et∶Es=lg-1(∑Xs/4)；Et=lg-1(∑Xt/4)。式中 Xs、Xt分别为细菌内毒素检查用水和稀释液制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。当 Es 在 0.5 λ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)时，且当 Es/Et在0.5～2.0（包括0.5和2.0）时,则认为供试品在该浓度下不干扰试验,结果见表2、3。干扰试验结果表明，阿昔洛韦葡萄糖注射液（1 mg/ml）对鲎试剂不干扰,可以用细菌内毒素检查法检查。

表2 鲎试剂批号为20060427的干扰试验结果

表3 鲎试剂批号为200606040的干扰试验结果

2.5 样品细菌内毒素检查

将3批供试品按文献[1]细菌内毒素检查法检查,分别用两个厂家鲎试剂进行细菌内毒素检查,结果见表4、5。结果表明，3批供试品细菌内毒素限值均＜0.5 EU/ml，均符合规定。

表4 阿昔洛韦葡萄糖注射液（样品1）细菌内毒素检查结果

表5 阿昔洛韦葡萄糖注射液（样品2）细菌内毒素检查结果

3 结论

3批产品干扰试验结果表明，阿昔洛韦葡萄糖注射液在稀释浓度下没有干扰，可以进行细菌内毒素检查,依据《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法规定原则,阿昔洛韦葡萄糖注射液采用细菌内毒素检查法代替家兔热原检查法是可行的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录85.

[2]黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志,1997,32(2):210.

[3]李海英,王琼芬.乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液的细菌内毒素检查[J].中国药业,2008,17(12):55-56.

[4]樊丽,赵金英.药品细菌内毒素检查经验总结[J].中国医药导报,2008,5(5)13:82.

[5]张琦,徐梅,王晓利.细菌内毒素法检查5%果糖注射液[J].中外医疗,2008,23:133.

[6]国明,祝清芬,郑力真.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析[J].中国药品标准,2008,9(1):49.