AGS3蛋白对吗啡慢性处理大鼠前额叶皮层神经元瞬时外向钾电流的影响*

赵 瑛，邬丽莎，杨 烨

(1.泸州医学院生理教研室，2.泸州医学院生化教研室，四川 泸州 646000;3.成都中医药大学眼科实验室，四川 成都 610075)

药物成瘾是一种以失去行为控制和强迫性连续用药为主要特征的慢性复发性脑疾病。机体脱瘾后有95%以上复发率，这是临床上难以根治成瘾的原因所在。研究发现，慢性给予可卡因的大鼠长期戒断后，一种非依赖受体活化的G蛋白信号转导激活因子3(activators of G protein signaling 3，AGS3)的含量在大脑前额叶皮质(prefrontal cortex，PFC)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)中显著升高[1]。用AGS3的反义寡核苷酸抑制AGS3的表达后，大鼠对药物的渴求行为消失[2]。所以推测，大脑内的AGS3可能在药物渴求和复吸等方面起着重要的作用。但是目前对于AGS3起作用的机制还不明确。

目前对于成瘾的研究主要集中于脑奖赏系统—中脑边缘多巴胺系统，大脑前额叶皮质是该系统的一个组成部分，它参与了药物成瘾相关的行为、情绪变化的调节和控制，而行为和情绪的改变直接受皮质兴奋性改变的影响[3]。目前虽然对NAc区的离子通道有所研究，但对成瘾机体与大脑皮质兴奋性改变有关的离子通道研究甚少，而瞬时外向钾电流IA(transient outward K+current)又与兴奋性密切相关。

本实验用全细胞膜片钳技术，观察吗啡慢性处理对大鼠前额叶皮质神经元瞬时外向钾电流的影响，并用信号转导相关蛋白AGS3的抗体阻断AGS3的作用，观察其对瞬时外向钾电流的影响，从而进一步探索AGS3蛋白在吗啡成瘾中的作用机制，为更好地研究控制成瘾的药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

SD乳鼠，雌雄不拘，由泸州医学院实验动物中心提供。

盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂制造，批号061202，10mg/ml)，4-AP 、TEA 、EGTA 、ATP-Mg、GTP 、phosphocreatin，胰蛋白酶(均购于Sigma)，HEPES(购于 Amresco)，DMEM/F12(Dulbecco'S Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(Ham)1∶1，Gibcol)，B-27(B-27 serum-free supplements，Gibco1)(购于 GIBCO)，AGS3(R-20)antibody(购自 Santa Cruz公司)，小牛血清购自(兰州民海生物)，阿糖胞苷(购自上海华联制药有限公司)，其余药品均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养方法 采用乳鼠大脑皮层神经元原代培养方法[4]。取出生24h内的SD大鼠，75%酒精消毒，在无菌条件下分离大鼠脑组织，置于预冷的解剖液中，在解剖镜下用眼科无齿镊小心分离并剔除血管等结缔组织，清洗分离出大脑前额皮层组织，用吸管把皮层组织移入离心管中，加入终浓度0.025%的胰酶5 ml，用吸管吹打脑组织至无明显组织块，静置5 min，取上清液入预置有5 ml DMEM 培养基的离心管中，终止消化，离心，1200r/min，8 min。弃上清，加入DMEM培养基5 ml，吹打混匀，离心，1200r/min，8 min。弃上清 ，加入含10%牛血清DMEM培养基5 ml吹打混匀，接种于24孔板中，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，24h后将培养基换成无血清培养基，以后隔3 d换液1次。细胞培养5 d后可用于膜片钳记录。

1.2.2 吗啡慢性处理细胞的方法 根据Liu等[5]的方法，用10μmol/L吗啡处理大鼠脑皮质神经元，48 h后用于膜片钳实验。

1.3 AGS3抗体对吗啡慢性处理细胞的作用方法

在大脑中AGS3蛋白主要在神经元中表达，免疫印迹和共聚焦成像显示，95%的AGS3主要分布于细胞质中[6]，为了使AGS3抗体与AGS3蛋白充分的结合，在我们的实验中，用电极液配置AGS3抗体成 10-3μg/L、10-2μg/L、10-1μg/L 三种不同浓度，AGS3抗体通过电极液导入细胞，使抗体与AGS3蛋白特异结合，作用时间2 h，记录IA。

1.4 记录电极及电极液

记录电极选硬质玻璃微电极，经微电极拉制仪(P-97 SUTTER INSTRUMENT CO.USA)两次拉制，拉成尖端为 1～2μm，电极内液阻抗为2～5 MΩ的玻璃微电极，用于全细胞电流记录。实验中电极液成分(mmol/L):KOH 110，KCl 20，Asp 110，MgCl21，HEPES 10，EGTA 5 ，ATP-Mg 5 ，GTP 0.1 ，phosphocreatin 5，以KOH调节pH值7.2。细胞浴液成分(mmol/L):NaCl 136 ，KCl 5.4 ，CaCl21.0，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 5，Glucose 10，CoCl23，以 NaOH 调节 pH值7.35。

1.5 全细胞膜片钳实验记录

在室温条件下(20～25℃)，利用Axopatch200B Axon膜片钳放大器进行全细胞记录，采样频率为10kHz，低通滤波频率为2 kHz。瞬时外向钾电流(IA)是一去极化激活的外向电流，刺激方案为:保持电位(-65 mV)，从-55 mV 去极化至+65 mV，阶跃 10mV，刺激频率0.5 Hz。

1.6 统计学处理

本实验采用不同处理组细胞组间对比观察，实验数据以均数±标准差()表示，采用SPSS10.0软件作两组之间t检验及方差分析。

2 结果

2.1 培养的SD乳大鼠皮层神经元IA的特性

在实验中记录到一快速激活与失活的外向电流，且呈电压依赖性，该电流可被2 mmol/L 4-AP抑制，而对TEA不敏感，即该电流为IA(图1)。

Fig.1 Identification of IA

2.2 吗啡对SD乳大鼠皮层神经元IA的影响

实验中吗啡的终浓度是 10μmol/L，处理 48 h。用全细胞膜片钳方式记录吗啡慢性处理组神经元IA的变化，吗啡能使大鼠皮质神经元电流明显升高(图2)。

Fig.2 Comparison of current density between the control and morphine group(，n=8)

2.3 AGS3抗体能抑制吗啡引起的IA升高，而对对照组无影响

当膜电位是+55 mV时，不同浓度的AGS3抗体作用于10μmol/L吗啡处理48 h后的细胞引起电流密度发生改变，10-3μg/L抗体对IA有抑制作用，但与吗啡处理组相比无显著的差异(P＞0.05)，10-2μg/L和10-1μg/L的抗体对电流密度的抑制均有显著性(P＜0.01)，但此两组之间效应无统计学差异(P＞0.05)。同等效应时取浓度较小者，故观察抗体对电流的效应时，抗体的浓度固定于10-2μg/L(表1，图 3)

Fig.3 Effect of AGS3 antibody 10-2μg/L on the current density of the control group and the morphine group at the membrane potential of+55 mV

Tab.1 Effect of AGS3 antibody on the current density of morphine group(，n=8)

Tab.1 Effect of AGS3 antibody on the current density of morphine group(，n=8)

**P＜0.01 vs current density of morphine group

Group(μg/L)Current density(pA/pF)Before using Anti-AGS3 After using Anti-AGS3 Change(%)10-3 64.52±15.50 62.76±9.96 -2.7210-2 67.44±18.25 41.61±12.70** -38.3010-1 63.28±15.94 35.06±5.67** -44.60

3 讨论

钾通道是一类存在于生物膜上对钾离子具有一定选择性通透能力的蛋白复合物，种类多、功能复杂，是所有真核生物细胞维持正常生理功能所必须的一大类跨膜蛋白。它能控制细胞膜内外钾离子的动态平衡，通过调节细胞膜电位而参与一系列生理和病理过程。神经元上钾通道的变化可引起膜兴奋性的改变。

本实验结果表明，慢性吗啡处理能增强前额叶皮质神经元IA，这一研究结果与文献报道的吗啡慢性处理增强新生大鼠尾核神经元电压门控性钾电流的研究相似，而在本研究中，该作用又被AGS3抗体所阻断，推测AGS3参与IA相关的信号转导通路。

Yao等研究指出，μ阿片受体的活化与药物渴求和复发相关，这可能与μ阿片受体的活化能使cAMP/PKA信号转导上调有关。在PFC和NAc中，μ阿片受体活化引起的PKA信号传递上调需要AGS3的参与，其作用机制可能是:一方面，AGS3与Gαi3结合，使βγ亚基激活下游的效应器ACⅡ和ACⅣ，进而使cAMP/PKA信号通路上调[7，8]，而该通路的活化是药物耐受依赖的细胞内机制。另一方面，在长期的可卡因处理后，大脑中AGS3蛋白水平持续升高，AGS3与Gi结合，由此可引起多巴胺D2/Gi调节的信号转导通路下调，同时加强多巴胺D1/Gs调节的信号转导通路[2]，也使细胞活性、AC、cAMP、PKA和下游的效应器(如CREB、Fos相关蛋白)的水平显著升高。这两条途径都使PKA的水平升高，诱导了钾通道的磷酸化而增加了IA通道的开放概率[9]。此外Gαi水平的下调，降低了对钾通道的抑制作用，激活K+通道，使神经元钾离子电流增加。

IA通道开放的增加，防止动作电位在树突的传播，降低神经元胞体和树突膜的兴奋性。兴奋性降低与全身乏力，始动性不足，懒惰，欣快感缺乏，情感反应淡漠，沮丧等精神行为改变有关。

在我们的实验中，AGS3抗体作用于吗啡处理的神经元，能抑制吗啡引起的IA升高，且呈剂量依赖性，而对对照组神经元钾电流无显著影响，推测其机制可能是AGS3抗体与AGS3蛋白特异性结合，阻断了AGS3蛋白在吗啡慢性处理中所引起的上述作用，使上调的cAMP/PKA信号转导通路恢复，减少了对钾通道的磷酸化而使IA的开放减少，而对对照组无影响是由于正常机体中AGS3的含量不足以引机体的反应。因此，AGS3蛋白在阿片类物质成瘾中的作用可能是通过与IA信号传递通路起作用，但仍然需要对该通路进行进一步的探讨。

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