促红细胞生成素对脑缺血/再灌注损伤的保护作用*

杨彦玲，朱文侠，陈雅慧，陈美霓

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

促红细胞生成素(erythropoietin，Epo)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白，主要作用是调节血液中红细胞的生成。目前发现，在正常人脑和缺血脑组织中都有 Epo及其受体(Epo receptor，Epo-R)表达[1，2]，但 Epo在脑缺血/再灌注后神经保护作用及其机制尚未完全明了。为此，本实验采用大鼠脑缺血/再灌注模型，观察外源性Epo对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用，为临床应用Epo治疗缺血性脑血管病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠32只，雌雄不限，清洁级，体重(300±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂与药品 重组人Epo注射液由沈阳三生制药股份有限公司生产，NO试剂盒、SOD活性检测试剂盒及MDA水平检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 4%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉后，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭两侧颈总动脉30min(动物出现呼吸加快，肢体痉挛，在19 s～1 min内出现昏迷)，松开动脉夹后即再灌注，动物分别在5～10min苏醒，再灌注24h。

1.2.2 动物分组 32只大鼠随机分成假手术组、脑缺血/再灌注组、Epo组及阳性对照组(尼莫地平，nimodipine，Nim)4组(n=8):假手术组，分离双侧颈总动脉，缝合，其余大鼠均建立大鼠脑缺血/再灌注模型，缺血30min再灌注24h。假手术组、脑缺血组于再灌注前腹腔注射生理盐水，Epo组于再灌注前腹腔注射3000U/kg Epo，阳性对照组再灌注前腹腔注射0.5 mg/kg Nim。缝合皮肤回笼饲养。

1.2.3 血清NO的测定 再灌注24h后麻醉大鼠，摘除眼球取血 1.5 ml，4℃ 4000r/min离心 10min，分离血清-20℃冰箱保存。待测血清NO水平。

1.2.4 海马区脑组织取材 开胸暴露心脏经左心室主动脉插管，快速灌注4℃生理盐水，迅速打开颅腔，断头取脑，取左右侧海马区脑组织-80℃冰箱冻存，待检测生化指标及脑组织含水量。

1.2.5 海马区脑组织SOD活性及MDA含量检测 称重右侧脑组织，用JY92-II型超声细胞粉碎机使细胞破碎，400A，每次5 s，间隔10s反复3～5次，制成10%的脑组织匀浆(冰浴匀浆)。0℃4000r/min离心15 min，取上清液。硫代巴比妥酸法测定海马区脑组织MDA含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

1.2.6 脑组织含水量的测定 取大鼠左侧海马区脑组织，经电子分析天平(分度值0.1 mg)精确称量，120℃恒温干燥箱烘烤48 h至恒重，称干重，计算含水量。含水量%=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清NO的变化

假手术组大鼠血清NO水平为(1.89±0.39)μmol/L，缺血/再灌注后NO水平显著升高，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。表明缺血/再灌注后有大量NO的产生。Epo组大鼠血清NO显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01)，阳性对照Nim组大鼠血清NO显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01，表1)。说明 Epo可以明显降低脑缺血/再灌注后NO的水平。

2.2 脑组织匀浆中MDA含量的变化

假手术组大鼠脑组织匀浆中MDA含量为(23.3±5.4)nmol/mg pro，缺血/再灌注后MDA水平显著升高，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。EPO组大鼠脑组织匀浆中MDA含量显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01)，阳性对照Nim组大鼠脑组织匀浆MDA含量显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01，表1)。提示Epo抑制脑缺血/再灌注损伤所致的脂质过氧化，使MDA含量下降。

2.3 脑组织匀浆中SOD活性的变化

假手术组大鼠脑组织匀浆中SOD含量为(30.1±6.36)U/mg pro，缺血/再灌注后SOD水平显著下降，与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。Epo组大鼠脑组织匀浆中SOD活性显著升高，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01)，阳性对照Nim组大鼠脑组织匀浆SOD含量显著升高，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.01，表1)。提示在大鼠脑缺血/再灌注损伤后Epo可以升高SOD活性，说明Epo具有抗氧化损伤的能力，保护神经细胞的完整性。

Tab.1 Effect of Epo on the content of NO andMDA，SOD activities and the cerebral water content in the medium of neural cells injured by ischemia/reperfusion(，n=8)

Tab.1 Effect of Epo on the content of NO andMDA，SOD activities and the cerebral water content in the medium of neural cells injured by ischemia/reperfusion(，n=8)

**P＜0.01 vs sham-operated;#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R

Group NO(μmol/L) MDA(nmol/mg pro) SOD(U/mg pro) Water(%)Sham-operated 1.89±0.39 23.3±5.4 30.1±6.36 77.8±3.2 I/R 7.20±1.74** 44.8±4.7** 15.3±3.11** 85.4±3.3**Epo 3.73±0.92## 35.2±5.5## 23.8±1.89## 82.1±3.0#Nim 3.18±0.84## 31.3±8.6## 25.4±4.03## 81.4±3.1#

2.4 脑组织含水量

正常脑组织含水量77.8%±3.2%，缺血/再灌注组脑组织含水量明显高于假手术组(P＜0.01)，Epo组脑组织含水量显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.05)，阳性对照Nim组脑组织含水量显著下降，与缺血/再灌注组相比有显著性差异(P＜0.05，表1)，表明Epo能显著减轻脑组织的水肿。

3 讨论

近年来研究证实，正常脑组织和缺血脑组织中都有Epo及其受体表达上调，并且发现Epo具有一定的神经保护作用，但其作用机制尚未完全明了，可能通过多种途径减少缺血后神经元的损伤[3]。

本实验用NO浓度代表自由基的生成量，用MDA反应脂质过氧化反应的程度，用SOD反应机体组织抵抗脂质过氧化的能力。结果显示脑缺血/再灌注组NO浓度显著增高，反映了脑缺血/再灌注后自由基的产生明显增加，腹腔注射Epo后，NO浓度较缺血/再灌注组明显降低，说明Epo减少自由基的生成。针对SOD活性和MDA浓度的统计分析同样说明Epo的使用可以降低脂质过氧化反应的程度，可以提高机体的抗脂质过氧化能力。本研究中，缺血/再灌注组脑组织含水量显著升高，Epo组脑组织含水量较缺血/再灌注组显著下降，说明Epo的应用能显著减少缺血区脑水肿的发生。

Epo在缺血性脑损伤中的神经保护机制比较复杂，可能包括:减少兴奋性氨基酸神经毒性作用，激活神经元内的抗氧化酶，抑制细胞凋亡，抑制NO的合成及抗自由基作用，增加神经细胞中胆碱乙酰转移酶的活性，促进脑功能全面恢复，诱导缺血损伤区的血管再生，增加缺血半暗带供血供氧，减轻缺血损伤后的炎症反应等[5]。本研究提示Epo保护神经元的机制可能是Epo通过一定的通路使缺血/再灌注后自由基生成减少、脂质过氧化反应减轻、脑水肿减轻等，起到了对神经细胞的保护作用。我们期望随着研究的深入，Epo将作为一种安全有效的神经保护剂应用于脑血管病的治疗。

[1]Hasselblatt M，Ehrenreich H，Siren A L.The brain erythropoietin system and its potential for therapeutic exploitation in brain disease[J].J Neurosurg Anesthesiol，2006，18(2):132-138.

[2]Kumral A，Genc S，Ozer E，et al.Erythropoietin downregulates bax and DP5 proapoptotic gene expression in neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Biol Neonate，2006，89(3):205-210.

[3]Gassmann M，Heinicke K，Soliz J，et al.Non-erythroid functions of erythropoietin[J].Adv Exp Med Biol，2003，543:323-330.

[4]Zhu D Y，Deng Q，Ya0H H，et al.Inducible nitric oxide synthase expression in the ischemic core and penumbra after transient focal cerebral ischemia in mice[J].Life Sci，2002，71(17):1985-1996.

[5]李中春，陈怀红.促红细胞生成素对缺血性脑损伤保护作用的研究进展[J].全科医学临床与教育，2005，3(1):51-54.