HIF-1α反义寡核苷酸体外对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α和VEGF表达的影响

付文琴，邓爱军，杜 玮，臧 萍

(1新疆维吾尔自治区哈密红星医院，新疆哈密839000;2潍坊医学院附属医院)

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物与人体内的一类转录因子，通过对缺氧诱导基因表达的调节，在维持机体对缺氧的适应能力中发挥重要作用。近来在部分缺血性视网膜疾病组织中发现HIF-1表达增加，与视网膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达及新生血管形成密切相关［1］。因此，HIF-1成为抗视网膜血管新生的重要靶点。2008～2009年，我们观察了HIF-1α反义寡核苷酸(ASODN)转染体外培养的牛眼视网膜微血管内皮细胞(BREC)后HIF-1α及VEGF的表达，探讨HIF-1α ASODN治疗视网膜新生血管性疾病的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 HIF-1αASODN序列根据GenBank HIF-1α基因 cDNA而设计。antisense为:5'-GCCGGCGCCCTCCAT3'。上海生工公司合成，并将各个磷酸键硫化修饰，其中5个OD260的HIF-1α ASODN 5'端标记荧光素(FAM);F12培养基(Gibco);EBM-2 Basal Meidum(北京毕特博);胎牛血清;Lipofectin脂质体(Invitrogen);兔抗HIF-1α多克隆抗体(武汉博士德)。二步法免疫组化试剂盒(北京中山公司)。其他试剂皆为分析纯。

1.2 细胞培养及分组 健康牛眼(死后3 h内取出)去除球外结缔组织，用700 ml/L乙醇浸泡1 min，PBS液冲洗后沿角膜缘后4 mm剪开眼球壁，完整剥出视网膜神经层，剪碎、匀浆，金属筛网过滤(孔径80 μm)，翻转筛网冲洗，洗脱液1 000 r/min离心7 min，37 ℃、0.2 g/L胶原酶I消化1～2 h，小牛血清终止消化，用PBS液离心洗涤，收集细胞，用含2 00 ml/L胎牛血清的M199和EBM-2混合培养液混匀，接种于包被有鼠尾胶原的培养皿内，放入50 ml/L CO2培养箱，37℃培养。次日将未贴壁细胞移入另一培养皿内，原培养皿内加入新鲜培养液继续培养，每3 d换液1次。细胞长至近融合状态时，用1 g/L胰蛋白酶消化、传代。采用第Ⅷ因子相关抗原检测法鉴定血管内皮细胞纯度为90%以上。无菌Eppendorf小管中，用无抗生素无血清的F12培养基，按每孔 HIF-1α ASODN 3 μg，Lipofectin 和HIF-1α ASODN为1∶5(g/L)将所需的 Lipofectin和HIF-1α ASODN 分别稀释至 100 μl，室温放置 10 min。将上述两管中液体混合，并用加样器轻轻打匀，室温放置45 min，使之形成寡核苷酸脂质体混合体。然后加入0.8 ml无抗生素无血清的F12培养基，使之总转染体积达到1 ml。将培养细胞分为转染组和未转染组。

1.3 细胞转染及缺氧处理 两组细胞分别接种6孔培养板(1×105/孔)，常规培养过夜。用4℃无抗生素无血清的培养基洗涤细胞3次，吸尽残存的培养基。转染组将寡核苷酸脂质体混合体逐滴加入培养板中，轻轻旋转混匀后放回培养箱继续培养。6 h后吸去含有寡核苷酸脂质体的培养基，洗涤细胞3次，除去细胞外未能进入细胞的HIF-1α ASODN;将6孔板置于荧光显微镜下观察摄片。转染6 h后，在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光斑。说明HIF-1α ASODN能被脂质体转染进BREC细胞。未转染组不行细胞转染。将未转染组和转染组细胞培养液中分别加入终浓度125 μmol/L的CoCl2，于缺氧 0、1、2、4、8、16 h 时行相关指标检测。每个时间点各测4个培养孔。

1.4 相关指标检测 ①HIF-1α表达检测采用免疫组化法。培养皿底放入盖玻片并固定，将培养细胞接种其中，待细胞到达合适密度后，-10℃甲醇固定5 min，冲洗后，3 g/L吐温30 min，PBS洗3次，每次2 min，1∶100稀释的 Rabbit Anti-HIF-1α 于 4℃过夜，PBS洗3次，每次2 min，滴加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育60 min，PBS洗3次，每次2 min。PBS液代替一抗作阴性对照。结果判定标准:荧光显微镜下(400×)HIF-1α蛋白以细胞核或胞质呈绿色荧光为阳性，每张切片随机选择5个视野，采用计算机图像分析系统进行荧光分析。②VEGF检测:采用ELISA法。操作步骤严格按照说明书进行，用酶标仪在492 nm处比色定量。对VEGF水平在标准曲线最高值以外的标本稀释10～100倍后重新测定。所有标本均作双管检查。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件。计量数据均以±s表示，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α表达 未转染组缺氧开始时HIF-1α有极低表达，在缺氧1 h时表达量显著上升，4 h达到高峰，16 h后下降。而转染组HIF-1α的表达始终在极低水平，两组间有显著性差异(P＜0.01)。见图1。

图1 两组HIF-1α免疫荧光分析结果

2.2 VEGF水平 见表1。

表1 两组缺氧各时间点培养上清液中VEGF 水平(ng/L，±s)

表1 两组缺氧各时间点培养上清液中VEGF 水平(ng/L，±s)

检测时间(h) 未转染组 转染组 P值0 65.25± 4.15 64.73±3.58 ＞0.05 1 75.32± 3.63 65.55±4.18 ＜0.05 2 98.23± 5.54 69.53±4.94 ＜0.05 4 169.55± 8.15 78.83±4.77 ＜0.01 8 258.92±15.32 92.79±6.49 ＜0.01 16 206.53±12.44 104.66±7.62 ＜0.01

3 讨论

视网膜缺血时释放的新生血管生长因子或血管源性生长因子是导致视网膜细胞异常增殖和新生血管形成的主要原因。目前研究表明，VEGF可能是最直接的眼球内新生血管形成因子，其可特异性地作用于血管内皮细胞，促进其增殖及新生血管形成;缺氧可上调其mRNA和蛋白质表达。HIF-1是从缺氧培养的细胞核粗提液中提取的一种具有DNA结合活性的蛋白质因子，广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答［2］，在缺氧诱导的基因表达调节中起关键作用，能诱导VEGF以及一些下游基因的表达，最终导致缺血组织的血管新生［3］。因此通过抑制HIF-1α表达从而抑制其下游VEGF基因的表达，可能成为抗新生血管治疗的一项新措施。

与传统药物或特异性抑制剂相比，ASODN直接作用于致病蛋白本身，更具有选择性，显示出高效低毒的优点，目前广泛应用于基因功能的研究和各种疾病的基因治疗。本研究以HIF-1α基因为靶点，设计合成了特异性的针对HIF-1α基因的ASODN序列，并成功转染BREC细胞。转染组HIF-1α表达明显低于对照组，证实HIF-1α ASODN能有效抑制HIF-1α的表达;转染组VEGF表达上调被明显抑制，抑制率明显高于对照组，证实HIF-1α途径对缺氧诱导的视网膜血管内皮细胞VEGF的表达具有重要作用。其主要机制:在VEGF的5'侧翼序列中含有5'-CGTG-3'的缺氧反应元件 ，缺氧时 HIF-1α、HIF-1β蛋白质均能由细胞质进入细胞核内，这一过程称为核转位，HIF-1α与HIF-1β形成稳定的HIF-1，后与靶基因DNA结合，从而使HIF-1α的C端反式激活结构域激活，诱导p300/CREB结合蛋白入核并与HIF-1及其他辅激活因子结合，形成转录起始复合物，启动VEGF基因的转录。HIF-1α ASODN转染细胞后，细胞内HIF-1α的表达被抑制，不能实现核转位，从而打断了这一途径，抑制了VEGF的表达［4］。但实验中发现，单纯抑制 HIF-1α途径尚不能完全阻断VEGF的表达，这可能与缺氧还通过其他途径调控VEGF的表达有关。目前认为缺氧除直接促进VEGF基因转录及保持VEGF mRNA的稳定性，使VEGF水平上调外，还有两种机制调控VEGF的表达:①局部自分泌的生长因子，刺激细胞生长的同时引起细胞以旁分泌方式分泌VEGF［5］;② 癌基因、抑癌基因直接参与VEGF的调控。Mukhopadhyay等［6］发现野生型p53可反向调节VEGF启动子，下调VEGF mRNA水平。

综上所述，BREC细胞转染HIF-1α ASODN后能抑制HIF-1α的表达，从而降低的VEGF表达。以HIF-1α为靶点的基因治疗有望成为视网膜新生血管性疾病治疗的新方向。

［1］Morita M，Ohneda O，Yamashita T，et al.HLF/HIF-2alpha is a key factor in retinopathy of prematurity in association with erythropoietin［J］.Embo J，2003(22):1134-1146.

［2］Deng AJ，Jing DY.Sequential changes of HIF-1αprotein and mRNA in hypoxic bovine retinal microvessels endothelial cells［J］.Int J Ophthalmol，2005，5(2):225-228.

［3］Safran M，Kaelin WG Jr.HIF hydroxylation and the mammalian oxygen-sensing pathway［J］.J Clin Invest，2003，111(6):779-783.

［4］Semenza GL.Regulation of Oxygen Homeostasis by Hypoxia-Inducible Factor 1［J］.Physiology，2009，24(2):97-106.

［5］Smith LE，Kopchick JJ，Chen W，et al.Essential role of growth hormone in ischemia indeced retinal neovascularization［J］.Science，1997，276(13):1706-1708.

［6］Mukhopadhyay D，Datta K.Multiple regulatory pathways of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor(VPF/VEGF)expression in tumors［J］.Semin Cancer Biol，2004，14(2):123-130.