癫痫大鼠海马CA3区凋亡相关蛋白表达及意义

刘晓梅，尤红娟，孙亚峰，关秋华，张光毅，裴冬生

(1徐州医学院基础学院，江苏徐州221004;2徐州医学院肿瘤生物治疗重点实验室)

癫痫发作可造成选择性的神经元凋亡及死亡。研究证实，细胞凋亡的发生依赖于死亡受体途径或线粒体途径;癫痫发作可导致线粒体 Bax的积聚［1］。2008年7月～2009年6月，我们观察了癫痫大鼠海马CA3区凋亡相关蛋白表达情况，探讨癫痫导致神经元凋亡的分子机制。

1材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠48只，体质量(230±20)g，清洁度Ⅱ级，由徐州医学院实验动物中心提供。将其分为观察组36只和对照组12只。KA购自Biomol公司;兔抗Bax多克隆抗体购自Cell Signaling公司;兔抗c-Jun、p-c-Jun、FasL、Fas、Bcl-2 多克隆抗体购自Santa Cruz公司;羊抗兔IgG购自Sigma-Aldrich公司;原位凋亡检测试剂盒购自Chemicon公司。

1.2 癫痫模型建立 观察组腹腔注射溶于生理盐水的海人藻酸(KA)12 mg/kg(体积为3.2 ml/kg);对照组腹腔注射等量生理盐水。注射3 h后观察组出现3次以上Ⅳ～Ⅴ级癫痫发作，即制模成功。

1.3 海马CA3区凋亡相关蛋白检测 采用免疫印迹法。KA注射后3、6、12 h及1、3 d各取6只大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，取其CA3区，匀浆，800 g×15 min于4℃离心，移取上清液为胞质部分，置-80℃冰箱待用。上清液移取后沉淀，加入0.5 ml的Buffer A洗1次，4℃、1 000 g×15 min离心，弃上清;再加0.5 ml的Buffer B于4℃摇匀30 min，4℃、12 000 g×15 min离心，小心移取上清液为胞核部分，置-80℃冰箱保存(以上操作均在冰水浴中进行)。采用改良Lowry's法，以牛血清白蛋白(BSA，fractionⅤ)为标准蛋白。等量蛋白样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以湿转或半干转法电转移至NC膜上，室温封闭3 h后加入一抗，4℃过夜，取出，洗膜3次，然后加入二抗，室温2 h，洗膜3次，NBT/BCIP显色。图像处理仪(Gene Company)分析 p-c-Jun、FasL、Bax、Bcl-2 的表达(以对照组为基准，用倍比数表示)。

1.4 海马CA3区神经元凋亡检测 制模7 d时，10%水合氯醛(0.36 ml/100 g)麻醉大鼠，以生理盐水和多聚甲醛行心室灌注［2］，断头取脑，用4%多聚甲醛固定12 h左右，梯度乙醇脱水，二甲苯透明(1.5 h)、60℃浸蜡(1 h×3次)。取出包埋，4℃保存。制作切片(厚5 μm)，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，行 TUNEL染色［3］，苏木素复染，光镜下观察凋亡神经元细胞(无完整细胞形态且着色为褐色)情况。以TUNEL法计数CA3区1 mm长度范围内凋亡神经元个数，取3个视野的平均数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件。计量数据以±s表示。组间差异用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马CA3区凋亡相关蛋白表达 见表1。

表1 两组海马CA3区凋亡相关蛋白表达(n=6，±s)

表1 两组海马CA3区凋亡相关蛋白表达(n=6，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与6 h比较，△P＜0.05

组别p-c-Jun FasL Bax Bcl-2观察组3 h 2.87±0.12* 1.26±0.20 2.28±0.17* 0.86±0.11 6 h 5.12±0.25* 5.65±0.18* 5.66±0.21* 0.65±0.13 12 h 4.98±0.16* 5.43±0.23* 5.54±0.16* 0.49±0.29*1 d 4.13±0.27* 2.76±0.18＊△5.61±0.14* 0.38±0.15*3 d 1.34±0.13△ 1.15±0.27 5.58±0.12* 0.23±0.10*对照组1.0 1.0 1.0 1.0

2.2 两组海马CA3区凋亡神经元的情况 制模7 d海马CA3区凋亡细胞，其胞核着色，并见核固缩，凝集，呈不规则形，出现凋亡小体。观察组及对照组凋亡细胞数分别为(177.0±24.7)、(21.4±6.8)个，P ＜0.05。

3 讨论

近年来细胞凋亡调节基因和受体引起临床关注，但其在癫痫发作过程中确切的分子机制尚不清楚。研究发现，在KA诱导的癫痫模型中，即早基因C-fos mRNA及其蛋白的表达水平在齿状回及海马的CA1、CA3区显著升高［6］;脑缺血再灌注引起的神经元细胞损伤可通过c-Jun的N-端激酶(JNK)下游的两条通路即核通路与非核通路介导［7，8］。一方面激活的JNK转录到核内，磷酸化转录因子c-Jun，可增强转录因子AP-1复合物活性并进一步促进多种凋亡蛋白表达，如FasL通过与受体Fas的结合，可启动Fas介导的凋亡信号通路;另一方面部分激活的JNK仍在胞质中，调节一些非核底物，进而促进细胞色素C的释放，启动线粒体介导的细胞凋亡通路。本研究结果显示，制模7 d大鼠海马CA3区可观察到大量神经元凋亡细胞;而在制模6、12 h，海马CA3区细胞核内c-Jun的磷酸化和表达即有显著升高，胞质中FasL的表达在制模6 h亦显著增加，而Fas的表达无明显变化。表明核通路介导了癫痫导致的神经元凋亡。

Bcl-2家族中抑制和促进细胞凋亡的两类蛋白比例决定细胞在受到外来信号刺激后是否发生凋亡。Bcl-2/Bax常以二聚体的形式结合在一起，一旦遇到外来刺激，Bax从二聚体释放，其过表达可拮抗Bcl-2的保护作用而诱导细胞凋亡。本研究观察组CA3区胞质中Bax蛋白表达于制模6 h急剧增加，并持续到第3天;而Bcl-2的蛋白表达却明显降低，提示非核通路亦介导了癫痫所致的神经元凋亡。

综上所述，c-Jun介导的核通路和Bcl-2、Bax介导的非核通路共同参与了癫痫所致的海马神经元凋亡;此为进一步研究癫痫发作诱导神经元凋亡的分子机制提供了实验依据。

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