纤维燃料乙醇生产中木糖发酵的研究进展

曹秀华，阮奇城，林海红，胡开辉，孙淑静，祁建民

（福建农林大学教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室，福州 350002）

农作物秸秆是一种具有多用途的可再生生物资源，也是地球上最丰富的有机物质之一。我国是一个农业大国，农作物秸秆数量大、种类多、分布广，长期以来则作为主要燃料或废弃、焚烧。严重污染了大气环境，制约了农村经济可持续性发展。能源危机已迫在眉睫，开发可再生能源已成为我国必须面对的重要课题。以淀粉类和糖类为原料生产燃料乙醇，考虑到粮食安全，已被叫停。以农作物纤维素类生产燃料乙醇，适应我国国情发展方向。目前，国际上纤维素乙醇产业化仍存在三大技术瓶颈，一是将木质纤维素类原料降解产生的木糖转化成乙醇较难，二是纤维素酶生产成本仍然偏高，三是原料要进行复杂的预处理。木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，可达植物纤维原料水解糖液的30%[1]，但木糖等五碳糖不能由传统酿酒酵母发酵产生乙醇。因此，筛选到能利用木糖发酵产乙醇的高效菌株，在木质纤维素转化燃料酒精的研究中具有重大意义。

1 木糖发酵菌种，包括天然菌种和基因工程菌株

目前在自然界中筛选到的能将木糖转化成乙醇的微生物主要有：细菌、丝状真菌和酵母菌。代谢木糖产生乙醇的细菌种类很多，除了能发酵单糖外还能发酵纤维素、生物高聚糖等，但细菌在发酵中会产生副产物且乙醇得率低，易染杂菌等。Lynda等发现一株极端嗜热的产乙醇细菌（Thermoanerobacter ethanolicus）可在 68℃高温下采用连续培养法转化木糖获得乙醇，其得率可达0.144g/g。丝状真菌中能利用木糖产乙醇的菌种较少，相关研究不多。有粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）等。丝状真菌能产半纤维素酶和纤维素酶，适于植物纤维原料的同步糖化发酵。与细菌的乙醇发酵相比，酵母菌具有酒精转化率高、得率高、酒精耐受能力高、副产物少、发酵过程不易污染等优点。酵母菌中可发酵木糖产乙醇的菌有：嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）、树干毕赤酵母（Pichia stipitis）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、酒香酵母（Bret tanomyces anomalus）和产朊假丝酵母（Candida utilis）等[2]。宋安东等曾用嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）对木糖和葡萄糖混合液共发酵生产燃料乙醇，发酵过程中糖利用率较高，发酵过程中先利用葡萄糖，在葡萄糖利用完后再利用木糖。菌体生长和乙醇产生随发酵时间延长而改变，发酵醪液中乙醇浓度为2%[3]。近年来许多研究者构建了可以同时高效代谢五碳糖和六碳糖的基因重组菌，对纤维质乙醇发酵的转化率有很大提高。

2 木糖发酵乙醇机理

将木糖转化成乙醇的细菌、丝状真菌和酵母菌的木糖代谢途径是不同的。大多数细菌（如E.coli和Bacillus等）首先在木糖异构酶作用下，将木糖转化为木酮糖，然后在木酮糖激酶的作用下磷酸化成磷酸木酮糖，继而进入磷酸戊糖循环（ppp途径）代谢，ED途径与ppp途径耦联，ED途径产生乙醇[4]。

利用木糖的酵母和丝状真菌的木糖代谢途径，首先是在依赖NADPH的木糖还原酶（XR）的作用下将木糖还原成木糖醇，然后在依赖NAD+的木糖醇脱氢酶（XDH）作用下氧化形成木酮糖，再经木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径（PPP）。PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸。丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶还原为乙醇；或在好氧条件下，通过TCA循环及呼吸链彻底氧化成CO2[5]。酵母的木糖发酵在兼性厌氧条件下进行，其总反应式为：

所以，木糖乙醇发酵乙醇的最高理论产率为0.46g酒精/g葡萄糖。低于葡萄糖酒精发酵的理论得率0.51g酒精/g葡萄糖。

3 木糖发酵菌的基因工程改良

能进行木糖乙醇发酵的天然菌种很少，通过基因工程技术获得新的菌种可提高木糖乙醇发酵能力，宿主菌株主要集中在大肠杆菌（E.coli）、运动发酵单胞菌（Z.mobilis）和酿酒酵母（S.cerevisiae）上。

3.1 木糖发酵重组细菌的构建

大肠杆菌（E.coli）含有利用木糖的所有必需酶，但厌氧条件下发酵形成的产物很复杂，包括乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸等，乙醇只是其中很少的一部分。生成乙醇的最后阶段是由丙酮酸脱羧酶（pdc）和乙醇脱氢酶（adh）催化进行的，E.coli缺少pdc，且adh水平低。KO11即是E.coli的基因重组菌株，能过量表达来自Z.mobilis的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB，从而能高效地将葡萄糖和木糖发酵为乙醇，乙醇产率为理论值的85%-92%[6]。孙金凤等从Z.mobilis的DNA中扩增出pdc、adhB，分别用lac启动子控制表达，构建了可以在E.coli JM109中表达的重组质粒pKK-PA、pEtac-PA，得到的重组菌几乎专一的发酵产生乙醇[7]。杨秀山等构建的大肠杆菌E.coli（pGM-PA）使乙醇产量有了明显的提高，固定化E.coli（pGM-PA）发酵混合糖的乙醇产率达到理论值的85%，木糖利用率达到80%，混合糖利用率达83%[4]。

Zhang等利用基因克隆在Z.mobilis中构建了能产生木糖异构酶（xylA）、木酮糖激酶（xylB）、转酮酶（tktA）、转醛酶（tal）的菌株。获得的重组菌Z.mobilis CP4（pZB5）可以五碳糖为碳源，乙醇产量可达理论产率的86%；在含木糖和葡萄糖各为25 g/L的混合碳源中培养，两种糖的乙醇产率均达到理论值的95%[8]。Mohagheghi等将发酵木糖和阿拉伯糖所需的7个基因整合到Z.mobilis染色体上的特异位点——乳酸脱氢酶基因（ldh）中，获得了一株稳定的整合重组菌株AX101，在赋予新菌株发酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同时，也减少了副产物乳酸的生成[9]。但重组菌株由于引入的基因存在于质粒上，稳定性较差，经连续发酵后质粒容易丢失而使发酵能力下降，并且对乙醇及纤维原料水解液中的抑制物耐受性差。

3.2 酵母菌的木糖代谢工程改造

酿酒酵母（S.cerevisiae）是传统的酒精生产菌株，具备良好的工业生产性状，其全序列已测定，遗传操作技术也已经成熟[10]。虽然酿酒酵母不能直接利用木糖，却具备木酮糖代谢的完整酶系[11]。不过，酒精代谢属于初级代谢，大多数微生物分享大量共同代谢途径，因此扩大酿酒酵母的底物范围，提高其对木糖的利用只需添加少数几个酶反应步骤即可。通常，微生物经2条独立路线将木糖转化为木酮糖，一是在木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的共同作用下分2步反应完成，常存在于酵母中；二是通过木糖异构酶直接转化为木酮糖，该反应在细菌中很典型[12]。通过途径工程理念，改造酿酒酵母代谢途径，使其具有共发酵葡萄糖和木糖产生酒精的能力，以此提高酒精转化率[13]。

早在1990年，Kotter等将树干毕赤氏酵母的木糖还原酶基因（XYL1）与木糖醇脱氢酶基因（XYL2）克隆到酿酒酵母中。重组酵母能在木糖为唯一碳源的培养基上生长，但不能发酵木糖产生乙醇，所利用的木糖全部被氧化[14]。

但研究发现，XYL1与XYL2相对表达水平的变化影响乙醇转化率；XYL2表达量的进一步提高，会导致木酮糖的累积分泌。木酮糖激酶催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖成为木糖代谢的限速步骤之一[15]。木酮糖激酶是木糖代谢途径中的一个关键酶，酿酒酵母自身的表达活性很低。如果过量表达木酮糖激酶，对木酮糖无限制的磷酸化催化在某种程度上会耗尽胞内ATP，从而引起细胞生长的毒害[16]。因此，木酮糖激酶的表达必须维持较适宜的水平。最近，Karhumaa等对嗜热细菌Thermus thermophilus的XI基因、XK基因及众多非氧化磷酸化途径酶基因的酵母菌株进行了研究，发现酿酒酵母对木糖的有效利用不仅依赖于从木糖到木酮糖的有效转化，也依赖于非氧化磷酸化途径对木酮糖的进一步有效代谢[17]。转酮酶（Transketolase，Tkl1）和转醛酶（Transaldolase，Tal1）是PPP途径中的关键酶，影响重组菌发酵木糖产生乙醇的能力，但酿酒酵母的这两种酶酶活都较低。鲍晓明等[18]以E.coli-S.cerevisiae穿梭质粒YEp24为骨架，将Pichia stipitis CBS6054的xyl1及xyl2分别放在酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅰ（ADH1）启动子和磷酸甘油激酶（PGK）启动子下，构建不同的xyl1及xyl2重组质粒，并在重组菌株中引入Tkl1和Tal1基因，使酵母菌在原有水平的基础上超表达合成转酮酶及转醛酶，这样得到的重组菌株可以在木糖为唯一碳源的平板上生长。摇瓶发酵实验结果表明，xyl1/xyl2比值为0.06的菌株，木糖较少被氧化，其他副产物也有所下降，乙醇得率有所提高。

引入细菌木糖异构酶基因（xylA）是使酿酒酵母转化木糖为木酮糖的又一途径。细菌的木糖异构酶因不需要任何辅助因子，最初被认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。早期多个研究将多种来源如E.coli、Bacillus subtilis、Actinoplanes missouriensis等的木糖异构酶基因克隆转化到酿酒酵母中，甚至已从重组酵母中得到外源xylA基因正确大小的蛋白产物，但均没有得到活性表达[19]，其可能原因是细菌和酵母最适pH不同，酶折叠不正确，或者后期翻译模式不合适[20]。直到1996年，Walfridsson等将古细菌嗜热细菌（Thermus thermophilus）的木糖异构酶基因（xylA）转入酿酒酵母，首次在酿酒酵母突变株XI中得到了活性表达[21]。Lonn等用易错PCR方法对T.thermophilus的xylA进行定向改造，以此解决其最适反应温度过高的问题，但效果仍不理想。突变株XI最适反应温度降至60℃，但其热稳定性却大大降低[22]。鲍晓明等从Thermus thermophilus克隆得到xylA，转化酿酒酵母，成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶活性表达，同时表达xylA和超表达TKl1和TAl1的酿酒酵母重组菌可以在木糖为唯一碳源的培养基上生长，经摇瓶发酵，该菌株可以发酵木糖生产乙醇，产量为1.3 g/L[23]。

4 展 望

木质纤维原料的主要成分为纤维素、半纤维素、木质素，在木质纤维原料转化为酒精过程中，如果能高效的将木糖转化为酒精，在理论上可提高乙醇产量达25%，可降低生产成本。由于很难在自然界中筛选到高效的木糖发酵菌，所以研究者开始致力于构建能高效利用六碳糖和五碳糖产乙醇的基因重组菌。目前基因重组菌的构建主要包括两个方面：一是将戊糖代谢途径引入只能代谢六碳糖产乙醇的菌株中；二是将高效产乙醇关键酶转入能代谢六碳糖和五碳糖但乙醇产量低的菌株中。目前研究表明，通过基因重组可以获得能高效转化六碳糖和五碳糖产乙醇的重组菌株。但在实际应用中仍存在问题，主要包括：菌种底物范围小；乙酸等抑制物耐受性低；乙醇耐受性较低；重组菌株不稳定；发酵过程中产生副产物并影响其发酵；发酵工艺需改良优化等。另外，所得重组菌株的应用还限制在实验室范围，还没有应用于工业化生产。因此，继续并加强对重组菌株构建和木糖代谢的研究，对提高木质纤维原料转化乙醇有十分重要的意义。

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