耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定

彭源德，朱作华，唐守伟，严 理，温 岚，汤清明，熊和平

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

石油作为国民经济发展的战略物资在经过人类近二百年的开采后，面临全球枯竭的局面。特别是近年来，随着经济的持续增长和石油需求迅速膨胀，我国已成为继美国之后的第二大能源消费国。针对我国人多地少、粮食紧缺和石油短缺的国情，依据不与人争粮、不与粮争地，能源原料多元化，实现持续发展的原则，开发非粮燃料乙醇生物能源，降低生产成本，提高转化效率，确保现代社会发展的需求，已成为国家新能源战略发展最紧迫的任务。传统酿酒酵母的酒精发酵最适温度不高，一般为25℃-30℃；耐酒性较差，耐酒精浓度在10%左右。一方面，在杂菌污染严重的情况下，生产上不仅要求无菌条件严格，操作难度较大，而且为了控制因发酵热所引起的温度上升，需要加入大量冷却水（甚至在部分气温较高地区，因发酵过程中过热，根本无法进行正常生产），导致乙醇生产成本增加[1-4]；另一方面，酵母的耐酒精度较低，产物的抑制作用降低乙醇酵母的产乙醇潜力。因此，耐受性酒精酵母的选育研究已成为国内外酒精行业的研究热点[5-8]。从自然界中直接分离筛选耐高温酒精酵母是育种工作中最经济适用的方法，国内外不乏成功的例子[9-11]。

本研究拟采用自然分离筛选与紫外诱变育种相结合的方法，获得耐高温、耐高浓度乙醇酵母菌，达到提高乙醇产率、减少燃料乙醇生产下游工程能耗和降低成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌样

菌样采自湖南、广东、广西和云南等四省（区）的12县（市），包括原始森林中的腐烂树叶、剑麻土、甘蔗渣、酒醪、塘泥、污水、稍微腐烂的水果和蔬菜等；对照菌株（CK）为市售的丹宝利高温活性干酵母。

1.1.2 试剂和工艺辅料

主要化学试剂有：无水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、TTC（三苯基四氮唑盐酸盐）、氢氧化钠溶液、盐酸和硫酸等，这些物质均为市售商品。

1.1.3 培养基

富集培养基：YPD液体培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖），自然pH；种子培养液：YPD液体培养基；平板分离培养基：YPD琼脂、PDA；初筛培养基：TTC上层培养基，TTC 0.05g、葡萄糖0.5g、琼脂0.5g、加入100mL无菌水；TTC下层培养基，YPD琼脂；发酵培养基（YFM）：150g/L的葡萄糖，0.5%酵母膏，pH值5.0；斜面保藏培养基：YPD琼脂。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取固体菌样30g左右，加入300mL无菌水中，120r/min摇10min，两层纱布过滤，收集滤液备用；液体菌样不处理，直接用于富集培养。

1.2.2 富集培养

取菌液10ml加入盛有富集培养基的锥形三角瓶中，添加适量的青霉素0.1‰-0.5‰抑制细菌的生长，于30℃恒温培养箱中培养2d，再取1ml进行同条件传代培养，每2d接种继代1次，3次继代后进行分离纯化。

1.2.3 分离纯化

将稀释的富集培养液，涂布于分离培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养2d，挑取典型酵母菌落至YPD琼脂斜面，编号、培养，性能鉴定后将酵母菌划线分纯、保藏。

1.2.4 酵母菌的初筛

利用产酒精能力强的酵母菌能还原三苯基四氮唑盐酸盐（TTC）变为深红色这一特性，筛选深红色菌落。将分离得到的各菌株依次接入TTC下层培养基的平皿中，培养24h，长出菌落后倒入TTC上层培养基，30℃下保温（阴暗处）2-3 h。比较各菌株之间的产酒精能力，初筛出产酒精能力强的酵母菌株，将酵母菌接种于YPD琼脂斜面培养基中，低温保藏。

1.2.5 酵母菌的复筛

将斜面菌种接一环于新鲜的种子培养液中，于30℃，170r/min摇床培养24h。按10%接种量将菌种接入装有100ml发酵培养基（YFM）的三角瓶中，于35℃培养箱，静置发酵72h后测产气情况和酒精含量。

1.2.6 诱变育种

以复筛后的酵母菌为始发菌，接种于种子培养液培养12h后，通过高温（45℃）处理20min、调整菌悬液浓度为106个/ml，取5ml于无菌平皿中，进行紫外线处理（照射功率15w、照射距离20cm、照射时间10min、杀伤率在99.99%以上），然后对菌液进行分离、富培、纯化和菌株表型特征观察，菌体进行镜检。同时，对始发菌和诱变菌株进行乙醇发酵试验，发酵液起始葡萄糖浓度200g/L。

1.2.7 耐受性试验

一般采用500ml锥形瓶盛培养液200ml，起始糖度为150g/l，接种量5%，自然pH，置35℃恒温静止培养72h，以丹宝利耐高温活性干酵母作对照，3次重复。根据研究目的设置的特定条件有：

①耐热性：分别在30℃、35℃、40℃和45℃条件下发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。

②耐乙醇能力：分别设置种子液的乙醇起始浓度为0%、4%、8%、12%、16%和20%，于35℃恒温培养24h，观察菌种生长，在660nm下测定培养液消光值（OD）。

③耐糖能力：分别设置发酵液糖的起始浓度为150g/l、200g/l、250g/l和300g/l，发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。

1.2.8 测定方法

酒精浓度采用酒精比重计法测定[12]。

2 结果与讨论

2.1 酒精酵母菌的筛选

酒精酵母菌的分离与筛选结果列于表1，从表中看出，采集的22个菌样中共分离出98个菌株，经初筛，获得12株酵母菌，占分离菌株的15.3%；酵母菌广泛分布于4省（市）12个县（市）的8类菌样中；经复筛，获得4株（编号分别为：S11、S12、S15、S17）耐高温的酒精酵母菌株，它们分别来自腐烂树叶、甘蔗渣、剑麻土和酒醪等菌样。

从不同温度下酵母菌的生长情况表2和表3可以看出，复筛出的4株酵母菌株均能在40℃下较好的生长，耐热性能与对照菌株丹宝利耐高温活性干酵母相当。

表1 酵母菌的分离与筛选结果Tab.1 Isolation and screeningofthermotolerant yeasts

表2 不同温度下菌落的生长情况Tab.2 Growth ofyeasts under different temperatures

表3 不同温度下酵母菌的吸光值Tab.3 ODvalues ofyeasts under different temperatures

2.2 耐受性酵母菌的诱变育种

为了进一步提高优良菌株S15和S17发酵能力，对它们分别进行了高温处理和紫外线诱变育种试验，酵母菌诱变育种结果表4表明，高温和紫外线处理对该2株菌的产酒精能力均有不同程度的提高；并获得了1株产酒精能力比CK高12.6%的酵母菌株，编号为S132。

表4 耐受性酵母菌诱变育种结果Tab.4 Ethanol tolerance comparison before and after mutant treatment

2.3 菌落和菌体特征

酵母菌在YPD琼脂平板及种子培养液中生长特征如表5。表中结果显示，酵母菌的菌落较湿润，表面光滑，容易挑取，菌落质地均匀，中间凸起，正反面以及边缘与中间的颜色较一致，菌落颜色比较单调，乳白色；液体培养基中均表现为底部生长，不形成膜或环；诱变处理获得的菌株S132的菌落形态和菌体特征见图1和图2，具酵母菌的典型特征，其属和种名有待于进一步鉴定。

表5 酵母菌的菌落形态特征Tab.5 Colonycharacteristics ofthermotolerant yeasts

图1 S132的菌落形态Fig.1 Colonycharacteristic ofyeast S132

图2 S132的菌体特征Fig.2 Cytomorphological characteristic ofyeast S132

2.4 耐受性初步鉴定

2.4.1 耐高温试验

表6列出了不同发酵温度对酵母菌发酵性能的影响结果，由表6看出，3株菌株在30℃和36℃均具有良好的发酵性能；S132和S15在40℃仍具有一定的发酵活性，与CK相比，发酵液乙醇浓度分别提高20.9%和14%，说明是很有潜力的耐高温酵母菌株。

表6 发酵温度对酵母菌发酵性能的影响Tab.6 Influence oftemperature on fermentation abilityofyeasts

2.4.2 耐乙醇试验

酵母菌在乙醇含量0-20%的YPD培养基中的生长情况见表7，从表中看出，四株酵母菌随着培养基乙醇浓度的增加，菌数不断减少，表明高浓度的乙醇含量会抑制酵母的生长繁殖。但S132对乙醇的耐受性大于对照，当培养基中乙醇含量为16%时，耐乙醇能力比对照高15%。

表7 不同乙醇浓度培养的酵母菌液消光值Tab.7 ODvalues ofyeasts fermented under different ethanol concentrations

2.4.3 耐糖性试验

酵母菌耐糖性试验结果如表8。由表8看出，S132和S15的耐糖性能与对照相当，发酵液糖浓度由150g/L提高到200g/L时，乙醇浓度大幅度增加；糖浓度在200g/L至300g/L时，乙醇浓度变化不大。

表8 发酵液起始糖浓度对酵母菌发酵性能的影响Tab.8 The effect ofstartingconcentration ofglucose on fermentation abilityofyeasts

3 结 论

采取自然分离筛选与诱变育种相结合的方法，是选育高耐受性酒精酵母经济适用的方法之一。通过本研究可以得出以下结论：①经富集培养，初筛、复筛，从22个菌样中共分离获得4株（编号分别为：S11、S12、S15、S17）耐高温的酒精酵母菌株，它们分别来自腐烂树叶、甘蔗渣、剑麻土和酒醪等菌样；②对S15、S17进行诱变育种，获得1株编号为S132的耐受性优良酒精酵母；③选育获得酵母菌的菌落较湿润，表面光滑，容易挑取，菌落质地均匀，中间凸起，正反面以及边缘与中间的颜色较一致，菌落颜色比较单调，乳白色；液体培养基中均表现为底部生长，不形成膜或环，具酵母菌的典型特征；④与对照丹宝利耐高温酵母相比，S132耐受40℃高温和乙醇的能力分别高出20.9%和15%，是一株良好的高耐受性酒精酵母。

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