组织因子对奥沙利铂抑制人胃癌细胞侵袭及诱导其凋亡的影响

郭 超,曹 农,俞永江,柴 琛,马海涛,李 强

(兰州大学第一医院,兰州 730000)

奥沙利铂是胃癌化疗的常用药,其作用机制为抑制肿瘤细胞的侵袭及转移、诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现,组织因子(TF)与肿瘤的侵袭及转移有关。2009年 5～12月,我们采用成功转染 TF-pcDNA3及空载体 pcDNA3的人胃癌细胞 SGC7901与奥沙利铂共同孵育,观察 TF对奥沙利铂抑制SGC7901细胞侵袭及诱导其凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 成功转染 TF-pcDNA3及 pcDNA3的SGC7901,Transwell小室,Matrigel,Caspase-3活性检测试剂盒,Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒,奥沙利铂。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与培养 将成功转染 TF-pcDNA3的 SGC7901作为实验组,转染 pcDNA3的 SGC7901作为对照组,均培养在含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基,置 37℃、5%CO2细胞孵育箱内。

1.2.2 细胞侵袭力观察 Transwell小室、细胞悬液的制备按说明书进行。将 Transwell小室放入 24孔板,取两组细胞悬液加入 Transwell小室,与奥沙利铂 10μg/ml共同孵育 24 h。检测 Transwell小室聚酯膜下表面的迁移细胞数,即高倍镜(×200)下随机取 4个视野,计数细胞核个数,取平均数,实验重复 3次。

1.2.3 Caspase-3活性及细胞凋亡率检测 将实验组和对照组细胞均以1×106/孔接种于6孔板,分别与 10、20、30、40 μg/ml奥沙利铂共同孵育 4、8、16、24 h。采用比色法检测 Caspase-3活性,以波长 405 nm处的吸光度值表示；Annexin-V/PI双染色法测算细胞凋亡率。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件。计量资料比较用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞侵袭力比较 实验组 Transwell小室底部聚酯膜表面细胞核数目为(38.7±3.6)个,多于对照组的(32.3±2.1)个,P＜0.05。

2.2 两组细胞 Caspase-3活性及细胞凋亡率比较见表1、2。

表1 两组细胞 Caspase-3吸光度值比较(±s)

表1 两组细胞 Caspase-3吸光度值比较(±s)

注:与对照组比较,*P＜0.05

组别 Caspase-3 4 h 8 h 16 h 24h实验组10μg/ml 0.036±0.002*0.042±0.003*0.059±0.005*0.072±0.004*20μg/ml 0.048±0.004*0.056±0.003*0.077±0.004*0.099±0.008*30μg/ml 0.057±0.004*0.065±0.003*0.091±0.009*0.130±0.010*40μg/ml 0.065±0.007*0.090±0.009*0.151±0.011*0.207±0.011*对照组10μg/ml 0.043±0.003 0.055±0.005 0.072±0.005 0.091±0.009 20μg/ml 0.057±0.003 0.068±0.006 0.089±0.005 0.122±0.005 30μg/ml 0.064±0.002 0.077±0.004 0.123±0.009 0.160±0.012 40μg/ml 0.076±0.006 0.116±0.011 0.168±0.012 0.286±0.012

表2 两组细胞凋亡率比较(%,±s)

表2 两组细胞凋亡率比较(%,±s)

注:与对照组比较,*P＜0.05,#P＜0.01

组别 细胞凋亡率4 h 8 h 16 h 24h实验组10μg/ml 1.01±0.30*1.78±0.29*2.72±0.45*3.56±0.23#20μg/ml 2.14±0.49*3.54±0.70*5.21±0.69#8.13±0.89#30μg/ml 4.04±0.52*5.81±0.41*7.31±0.78*15.20±1.20#40μg/ml 6.93±0.71*8.67±0.66*13.40±1.32#22.77±1.95#对照组10μg/ml 1.74±0.31 2.65±0.38 3.93±0.58 5.57±0.65 20μg/ml 3.85±0.68 5.95±1.07 8.81±0.98 14.52±1.41 30μg/ml 5.32±0.55 7.05±0.62 10.33±1.09 21.10±1.00 40μg/ml 8.03±0.90 11.03±1.36 16.90±1.59 28.00±2.41

3 讨论

研究表明,TF不仅在人体正常细胞广泛表达,在多种肿瘤细胞也高表达,并表现出许多非凝血功能。Poon等[1]通过对手术切除肝癌标本行免疫组化研究发现,TF与肝癌血管生成、侵袭、转移及患者预后明显相关。Takano等[2]研究认为,TF是一种胶质细胞瘤血管生成的调节因子,在恶性程度较高的胶质细胞瘤细胞及新生血管内皮细胞中呈高表达。

本研究发现,转入 TF-pcDNA3的 SGC7901细胞较转入 pcDNA3的 SGC7901细胞迁移数明显增高,而 caspase-3活性及细胞凋亡率降低,提示 TF通过细胞凋亡、细胞侵袭途径对奥沙利铂的体外化疗作用产生影响,从而降低其疗效,影响胃癌患者的预后。TF在化疗过程中产生影响的机制并未完全阐明。Camere等采用基因芯片法筛查人角质细胞 TF与 FⅦa结合前后基因表达谱的改变,发现包括 cfos、EGF、IL-1等 24种基因上调,而上述细胞因子或癌基因的激活可促进肿瘤细胞的侵袭和上调 MMPs表达,MMPs能使肿瘤细胞周围基质降解,从而参与肿瘤细胞侵袭的调控[3]。有研究表明,TF/FⅦa复合物能通过激活 PI3K/Akt信号转导抑制去血清诱导的幼仓鼠肾细胞凋亡[4,5],提示 TF可能是通过与FⅦa形成 TF/FⅦa复合物,进而激活信号转导对肿瘤细胞凋亡、侵袭产生影响。高表达的 TF可使肿瘤组织局部形成高凝环境,高凝环境中大量纤维蛋白及瘤栓形成,可将肿瘤细胞与不利于其存活的环境隔离,使其躲避机体免疫系统的监视并免受抗肿瘤药物的攻击[6]。肿瘤细胞可能通过 TF活化凝血途径产生的凝血酶起到降解、改变细胞外基质的作用[7],从而易于存活、增殖、黏附、侵袭以及转移。我们认为,TF可以降低奥沙利铂对人胃癌细胞侵袭力的抑制作用,减弱奥沙利铂诱导的凋亡,可能影响肿瘤的转归及预后。有关 TF产生上述作用的详细机制,有待进一步深入研究。

[1]Poon RT,Lau CP,Ho JW,et al.Tissue factor expression correlates with tumor angiogenesis and invasiveness in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(14):5339-5345.

[2]Takano S,Tsuboi K,Tomono Y,et al.Tissue factor,osteopontin,alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomas associated with vascular endothelial growth factor expression[J].Br J Cancer,2000,82(12):1967-1973.

[3]Camerer E,Rottingen JA,Gjernes E,et al.Coagulation factors VIIa and Xa induce cell signaling leading to up-regulation of the egr-1 gene[J].J Biol Chem,1999,274(45):32225-32233.

[4]Sorensen BB,Rao LV,Tornehave D,et al.Antiapoptotic effect of coagulation factorⅦa[J].Blood,2003,102(5):1708-1715.

[5]Versteeg HH,Spek CA,Richel DJ,et al.Coagulation factorsⅦa andⅩa inhibit apoptosis and anoikis[J].Oncogene,2004,23(2):410-417.

[6]Lykke J,Nielsen HJ.The role of tissue factor in colorectal cancer[J].Eur J Surg Oncol,2003,29(5):417-422.

[7]张剑权,万远廉.组织因子促进肿瘤侵袭及转移的研究进展[J].中华实验外科杂志,2007,24(3):382-384.