白藜芦醇对人食管癌细胞 Eca-109增殖的影响及其机制探讨

韩忠敏,井长勤

(1郑州铁路职业技术学院,郑州 450052；2新乡医学院)

白藜芦醇(Res)属非黄酮多酚类物质,是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物,因首先在欧洲的白藜芦中被提取而得名。体内外实验发现,Res对肿瘤的起始、发展均有抑制作用[1]。新生血管生成是肿瘤细胞增殖生长的必备条件,血管内皮细胞生长因子 (VEGF)是最重要的血管内皮生长刺激因子。2008年 6月 ～2009年 1月,我们观察了 Res对人食管癌细胞 Eca-109增殖的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Eca-109,常规培养于含 10%胎牛血清的 DMEM培养基中,置 37℃、饱和湿度为 5%的CO2培养箱孵育,0.25%胰酶-EDTA消化传代至对数生长期；Res(纯度 99%),用二甲基亚砜(DMSO)溶解,母液浓度为 100 mmol/L,-20℃避光保存；DMEM培养基,总 RNA提取试剂盒,cDNA合成试剂盒及 PCR扩增试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 Eca-109细胞增殖情况观察 采用 MTT法。调整细胞浓度为 1.5×104/ml,取 200μl接种于 96孔板。24 h后观察组加入终浓度为 10、20、40 μmol/L的 Res,对照组加入 DMSO,每组设 4个复孔。于培养 24、48、72 h,吸尽旧培养液,每孔加 20 μl MTT(5 g/L)继续培养 4 h。吸尽培养液,加入DMSO,振荡至紫色结晶完全溶解。用酶标仪测定每孔 570 nm的吸光度 A值,计算细胞生长抑制率(IR)。IR(%)=(实验组 A570-对照组 A570)/对照组 A570×100%。

1.2.2 Eca-109细胞 VEGF mRNA检测 采用 RTPCR法。应用 Primer 5.0软件设计 VEGF引物序列,由上海生工生物公司合成。以管家基因 GAPDH的 cDNA起始模板数对 VEGF基因的起始模板进行标化,设定无 cDNA样品的空白管为阴性对照。采用 Trizol一步法提取总 RNA,紫外分光光度计测样品 A260和 A280值,琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA质量。按逆转录试剂盒说明书操作,反转录合成 cDNA,用以 PCR反应。PCR扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳、EB染色。凝胶图像分析系统以 VEGF与 GAPDH电泳带的吸光度比值作为 VEGFmRNA表达量。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS12.0软件分析。数据比较用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组 Eca-109细胞 IR比较 见表1。

表1 两组 Eca-109细胞 IR比较(%,±s)

表1 两组 Eca-109细胞 IR比较(%,±s)

注:与对照组比较,*P＜0.05,#P＜0.01

组别 IR 24 h 48 h 72 h观察组10μmol/L 3.20±0.02* 6.71±0.02* 13.52±0.12*20μmol/L 23.32±2.13*43.21±3.87* 54.52±2.87*40μmol/L 46.72±3.89*65.08±5.70# 87.71±3.70#对照组 0 0 0

2.2 两组 Eca-109细胞 VEGF mRNA表达比较见表2。

表2 两组 Eca-109细胞 VEGF mRNA表达比较(±s)

表2 两组 Eca-109细胞 VEGF mRNA表达比较(±s)

注:与对照组比较,*P＜0.01,#P＜0.05

组别 VEGF mRNA 24 h 48 h 72 h观察组10μmol/L 1.102±0.054*1.010±0.052*0.875±0.254#20μmol/L 0.912±0.046*0.835±0.043*0.526±0.312#40μmol/L 0.212±0.032*0.156±0.025*0.107±0.209#对照组 1.814±0.062 1.711±0.059 1.426±0.326

3 讨论

Res是许多植物在受到真菌感染、紫外线照射或病理状况下产生的一种植物抗毒素,具有多种生物活性,因其对肿瘤的抑制作用而备受关注,被认为是天然化学防癌剂之一。目前,对 Res的抗癌机制尚不清楚,认为其抗癌机制是多途径的。Latruffe等[2]研究发现,Res可以抑制肝癌细胞 HepG2及结肠癌 SW480细胞从 S期进入 G2/M期,并呈剂量依赖关性。Park等[3]研究表明,Res能诱导人早幼粒白血病细胞向非增殖表型分化,提示其在肿瘤发展阶段亦有明显的抑制作用。乔振奎等[4]研究发现,Res可通过抑制前列腺癌细胞株 PC-3中 VEGF-C的表达发挥抗肿瘤活性。李永军等[5]采用流式细胞技术检测 Res诱导食管癌 Eca-109细胞凋亡的作用,认为与其增加细胞凋亡相关基因 survivin、Bax和 Bc1-2的表达有关。

VEGF是体内外血管内皮细胞最主要的有丝分裂原,通过选择性地与血管内皮细胞膜上高亲和力的受体酪氨酸激酶结合,使受体磷酸化而活化,然后进一步激活其下游的相关基因表达,刺激内皮细胞迁移与增殖；同时,VEGF也可增加血管内皮的通透性,血液中的营养物质进入肿瘤细胞间隙,使肿瘤直接获得营养；此外,VEGF还能诱导某些抗凋亡因子如 Bcl-2、X1-AP等的表达,抑制血管内皮细胞凋亡。叶春祥等[6]研究发现,VEGF在食管鳞状上皮细胞中的异常表达与食管癌组织中淋巴管生成和淋巴结转移密切相关,说明 VEGF表达水平可作为食管癌患者预后判断及转移的参考指标。

本研究结果发现,Res对食管癌细胞 Eca-109增殖具有抑制作用,且随药物浓度的增加,培养时间延长,抑制率升高,呈时间和剂量依赖关系；RT-PCR证实,一定浓度的 Res对 Eca-109中 VEGF mRNA的表达有抑制作用,提示 Res可能通过抑制食管癌细胞中 VEGF基因的表达而发挥抗肿瘤作用,为临床 Res治疗食管癌提供了理论依据。

[1]Kundu JK,Chun KS,Kim SO,et al.Resveratrol inhibitsphorbol ester-induced cyclooxygenase-2 expression in mouseskin:MAPKs and AP-1 as potential molecular targets[J].Biofactors,2004,21(1-4):33-39.

[2]Latruffe N,Delmas D,Jannin B,et al.Molecular analysiss on the chemopreventive properties of resveratro,a plantpolyphendmicrocomponent[J].Int JMol Med,2002,10(6):755-760.

[3]Park JW,Choi YJ,Jang MA,et al.Chemopreventive agent resveratrol,a natural product derived from grapes,reversibly inhibits progression through S and G2 phases of the cell cycle in U937 cells[J].Cancer Lett,2001,163(1):43-49.

[4]乔振奎,徐万海,王晓民,等.白藜芦醇对人前列腺癌 PC-3细胞株 VEGF的表达及细胞增殖的影响[J].实用肿瘤学杂志,2009,23(3):242-244.

[5]李永军,孙晓慧,王崇.白藜芦醇诱导食管癌细胞凋亡及其相关基因表达的研究[J].检验医学,2009,24(3):196-200.

[6]叶春祥.VEGF-C在食管癌中的表达及其与淋巴结转移相关性研究进展[J].四川生理科学杂志,2009,31(1):35-36.