黄芪对慢性阻塞性肺病大鼠气道炎症干预作用实验研究

杨 月,侯继申,池红井,范常艳,韩 梅

(承德医学院附属医院,河北承德 067000)

黄芪类化合物有多种生物学活性,具有调节免疫、抗病毒等多方面的药理作用[1]。黄芪的有效成分黄芪总酮(TFA)和黄芪总皂甙(AST)具有清除氧自由基的能力,可防止生物膜的脂质过氧化,TFA的抗氧化作用可能是其抗炎作用的机制之一[2]。2008年3月 ～2009年 1月,本实验选择熏香烟加气管内注入脂多糖(LPS)法[3]致慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型,探讨黄芪对 COPD大鼠气道炎症是否具有抑制作用,为临床应用黄芪治疗 COPD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康 SD大鼠 30只,体质量(210±20)g,雌雄不限,由辽宁医学院实验动物中心提供。随机分成 3组,每组 10只。①正常对照组:在正常环境下饲养,第 8天起每天腹腔注射0.9%生理盐水 0.05 ml/kg,第 28天处死。②COPD模型组:将大鼠于第 1、14天气管内注入 LPS各 200 μg/200μl,第 2～13天、第 15～28天每天在 70 cm×50 cm×50 cm的密闭箱内吸烟,吸烟量为 14支/次,2次/d,其中每次吸烟时间 1 h,两次吸烟间隔为1 h。第 8天起每天腹腔注射 0.9%生理盐水 0.05 ml/kg,至第 28天处死。③黄芪干预组:气管内注入LPS及熏香烟过程同 COPD组,第 8天起每天腹腔注射黄芪注射液 250 mg/kg,至第 28天处死。

1.2 大鼠血清采集 将大鼠用 2%戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后,用毛细玻璃管(内径 1.0 mm)在大鼠眶下静脉丛取静脉血 1 ml,室温下静置约 1 h,充分凝固后置 4℃过夜,以 1 500 r/min离心 30 min,吸取上部清亮的血清保存于 -20℃冰箱中待检。

1.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)采集 切开胸部,暴露气管及肺部,结扎右主支气管,在隆突上用套管针穿刺至左肺,以 2 ml生理盐水灌洗左肺,每次回收约 1.5 ml(回收率 75%),反复灌洗 3次,总回收量约 4.5 ml。将收集到的 BALF经纱布过滤,离心,取上清液置入 EP管保存于 -20℃冰箱中待检,收集下部 2 ml左右,混匀作细胞计数。

1.4 气管和肺组织采集 松开结扎的右主支气管,将毛细玻璃管固定于右主支气管内,向右肺内注入10%中性甲醛溶液,使肺复张,取中叶肺组织 1 mm3大小,置于 4%戊二醛中；取隆突上 2～3 mm处的气管及中叶肺组织 5 mm3大小,置于 10%中性甲醛溶液中。将经过 10%中性甲醛溶液固定的肺组织和气管,在垂直于支气管、细支气管断面的右肺中叶矢状面最大周径处进行横贯取材,酒精梯度脱水；二甲苯透明标本 2～3次,每次 5 min；浸蜡(时间 ＞3 h),包埋,切片(厚 5μm),HE染色。将经过 4%戊二醛固定的 1 mm3右肺组织漂洗,用 2%四氧化锇后固定 2 h,再漂洗,丙酮梯度脱水,包埋,聚合；超薄切片(厚 0.1μm),醋酸铀—枸橼酸铅电子染色。

1.5 炎症指标检测 采用放射免疫法测定各组大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的含量,操作按试剂盒说明步骤进行。

1.6 统计学方法 采用 SPSS 12.0软件进行统计学分析,计量资料以±s表示,两组间数据比较用t检验,3组间数据比较用单因素方差分析,以 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 正常对照组大鼠毛发顺滑,有光泽,神情活泼；COPD组大鼠毛发失去光泽,黄涩,神情倦怠；黄芪干预组大鼠毛发顺滑,有光泽,但神情较正常对照组略呆板。第 28天正常对照组体质量(241.6±21.5)g、COPD组 (225.3±19.1)g、黄芪干预组(230±17.3)g,3组之间比较差异无统计学意义。

2.2 病理形态观察

2.2.1 肺大体形态观察 正常对照组大鼠肺表面光滑平整,呈淡粉红色,质地均匀,弹性适当；COPD组大鼠肺呈膨胀状态,体积较正常对照组明显增大,颜色苍白,弹性减弱；黄芪干预组较 COPD组有改善但不如正常对照组。3组大鼠肺组织表面均无出血,无液体渗出。

2.2.2 光镜观察 正常对照组镜下可见大鼠正常气管及各级支气管上皮,纤毛丰富、排列整齐,在纤毛细胞间夹杂有少数杯状细胞,肺泡结构完整,肺泡间隔无破坏；COPD组大鼠气管及各级支气管可见不同程度的炎症细胞(淋巴细胞、中性粒细胞)浸润,黏膜上皮可见纤毛倒伏、粘连或脱落,纤毛细胞可见变性、坏死或脱落,杯状细胞明显增多,胞体增大。周边肺组织普遍存在小叶中央型肺气肿,表现为肺泡结构紊乱,肺泡壁变薄断裂,肺泡腔扩大,部分融合为肺大疱；黄芪干预组大鼠肺组织炎症细胞浸润减少,支气管黏膜上皮纤毛脱落及肺泡壁变薄、断裂等损伤现象有所改善。

2.2.3 电镜观察 正常对照组气管、支气管黏膜上皮细胞纤毛排列整齐,无脱落,肺泡上皮细胞器结构正常,肺气血屏障结构完整,毛细血管内皮细胞无肿胀及空泡变性；COPD组Ⅰ型肺泡上皮细胞肿胀和脱落,杯状细胞分泌增加,Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,板层小体排空,线粒体肿胀,空泡变性,内质网扩张,核固缩,表面纤毛减少脱落,肺泡腔内的巨噬细胞溶酶体增多；黄芪干预组Ⅰ型肺泡上皮细胞肿胀和脱落,Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀、板层小体排空等损伤有所改善。

2.3 BALF细胞计数 见表1。

表1 3组大鼠 BALF细胞计数比较(±s)

表1 3组大鼠 BALF细胞计数比较(±s)

注:与正常对照组比较,*P＜0.01；与COPD组比较,△P＜0.05

组别 白细胞(×108/L)中性粒细胞(×108/L)中性粒细胞百分比(%)正常对照组 1.98±0.96 0.125±0.013 5.82±3.60 COPD组 5.76±0.29*1.160±0.132*19.81±4.12*黄芪干预组 2.52±0.13△ 0.196±0.124△ 7.28±3.35△

2.4 炎症指标 见表2。

表2 3组大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的水平比较(pg/ml,±s)

表2 3组大鼠血清和 BALF中 IL-8和 TNF-α的水平比较(pg/ml,±s)

注:与正常对照组比较,*P＜0.05,△P＜0.01；与 COPD组比较,#P＜0.05

组别 IL-8血清 BALF TNF-α血清 BALF正常对照组 39.8±14.5 101.5±16.4 68.6±12.3 70.6±8.9 COPD组 79.6±5.9△ 243.4±21.1△ 98.3±21.1*135.8±16.7△黄芪干预组 47.6±3.8#115.1±17.6# 75.4±15.2#78.1±10.8#

3 讨论

细胞因子 TNF-α、IL-8与 COPD的病理生理机制有密切的关系。本研究 COPD大鼠 IL-8、TNF-α的水平较正常对照组增高[4]。IL-8是选择性 PMN趋化因子,在 COPD气道炎症中的作用主要是通过趋化、激活 PMN和嗜酸性粒细胞等炎症细胞,使之合成、释放 IL-8、TNF-α等细胞因子和炎症介质,进一步加重 COPD气道炎症反应,加重肺组织与气道结构的病理损害。TNF-α是具有多种免疫功能的调节因子,在 COPD气道炎症中可促进炎症细胞黏附、游走和浸润,迅速引起肺损伤[5]。在生理情况下,TNF-α可刺激花生四烯酸类炎性物质释放,在并发感染情况下,这种刺激更明显,其结果可诱发过度炎症反应。在 IL-8基因的增强启动区域内含有对TNF-α的功能反应成分,因此 TNF-α可以在转录水平刺激 IL-8的合成,TNF-α、IL-8共同参与 COPD气道炎症反应及气道结构的重塑。本研究黄芪干预组大鼠 BALF和血清中 TNF-α、IL-8浓度较 COPD组下降。IL-8的下降可减少 PMN在肺内的聚集,从而减缓气道炎症的进展。AST可减少渗出液中 IL-8的含量,降低渗出液及 PMN中磷脂酶 A2活性,减少 PMN超氧阴离子生成及渗出液中一氧化氮的生成量。而黄芪多糖可增强血管内皮细胞与白细胞的黏附,并对 TNF-α、IL-1促进内皮细胞与白细胞黏附有协同增强作用,从而发挥抗炎作用[6]。此结果提示,通过对 TNF-α、IL-8的抑制,使炎症细胞的聚集、趋化减轻可能是黄芪干预 COPD气道炎症反应的机制之一。

本研究显示,经黄芪治疗后,COPD大鼠 BALF中白细胞总数、PMN绝对计数和百分比降低。可见黄芪对 COPD气道炎症有一定的治疗作用,可部分改善气道腔中以 PMN为主的炎症。抑制炎症细胞的机制可能在于黄芪激发了肾上腺皮质功能,而皮质激素具有较强的抗炎作用,能影响白细胞的移动和分布,抑制某些生物活性物质的释放,增强机体抗炎、抗缺氧的能力。其次,APS通过促进内皮细胞表面黏附分子的表达而促进 PMN与内皮细胞的黏附,从而抑制炎症反应。氧化/抗氧化失衡参与了COPD的发病过程。实验证实,AST可使角叉菜胶诱导大鼠气囊的渗出液量、PMN游出数和蛋白渗出量明显减少,其抗炎机制与抑制白细胞游出,减少IL-8、一氧化氮等炎症介质的产生及抑制氧自由基生成有关[7]。黄酮类化合物抗炎作用是以其抗氧化活性为基础的,与抗自由基或抗脂质过氧化有关。

总之,COPD的发病机制是非常复杂的,非特异性炎症是其共同的病理表现。TNF-α、IL-8参与了COPD的发病过程,中药黄芪可一定程度下调 COPD时 TNF-α、IL-8的表达,减少气道炎症细胞的浸润,对 COPD大鼠气道炎症有抑制作用。

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