RP-HPLC法测定施普睿达原料药中主药的含量Δ

徐 阳，刘培勋，禹 洁，王育苗，龙 伟，马世堂

（中国医学科学院北京协和医学院，放射医学研究所，天津分子核医学重点实验室，天津市 300192）

豆科槐属植物体内含有为数不少的具有生物活性的生物碱，其中部分生物碱具有一定的抗肿瘤作用[1]。施普睿达是豆科槐属植物生物碱经半合成得到的抗肿瘤生物碱衍生物。建立其质量标准并进行方法的验证是进行抗肿瘤药效学研究的保证。经过反复验证，笔者建立了用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定施普睿达含量的有关方法。该方法系统适用性好、简便、准确可靠、重复性好，适合施普睿达的含量测定。

1 仪器与试药

Alliance 2695 HPLC仪，包括Empower工作站、PDA 2998检测器（美国Waters公司）；AUY220电子分析天平（日本岛津公司）；PB-10pH仪（德国Sartorius公司）。

施普睿达对照品（批号：2009224，用3种不同流动相、经面积归一化法测定，纯度均大于99.0%；并经3种不同展开剂薄层色谱结果鉴定）和供试样品施普睿达原料药（批号：2009316、2009319、2009409；面积归一化法测定纯度分别为99.0%、95.2%、97.5%）均为本所自制；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SunFireTMRP C18（500 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲溶液（pH＝3.01）∶乙腈＝9∶1；流速：1 mL·min－1；检测波长：220 nm；进样量：10 μL；柱温：25 ℃；在上述色谱条件下，按施普睿达峰面积计算理论塔板数不低于5000。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备。精密称取施普睿达对照品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶内，加流动相制成浓度为1 mg·mL－1的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备。精密称取施普睿达供试品25 mg，置于25 mL棕色容量瓶内，加流动相制成浓度为1 mg·mL－1的供试品溶液，备用。

2.3 方法专属性的考察[2]

2.3.1 施普瑞达与起始原料以及中间产物的分离。精密称取施普瑞达对照品5 mg、原料槐定碱5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流动相定容。进样10 μL，记录保留时间。精密称取施普瑞达对照品5 mg、中间产物奥赛博思5 mg同置于10 mL容量瓶中，用流动相定容。分别进样10 μL，记录保留时间。结果见图1。

由图1可见，各化合物均能有效分离。

图1 高效液相色谱图A.施普瑞达对照品；B.供试品；C.施普瑞达+槐定碱；D.施普瑞达+奥赛博思；1.施普瑞达；2.槐定碱；3.奥赛博思Fig 1 HPLC chromatogramA.Sprida control；B.test sample；C.Sprida spiked with sophoridine；D.Sprida spiked with aosaibos；1.Sprida；2.sophoridine；3.aosaibos

2.3.2 降解试验。称取4 mg施普睿达供试品，置于10 mL容量瓶内，放置在170℃的干燥箱内，5 h后，加入10 mL流动相溶解，作为高温破坏溶液；称取4 mg施普睿达供试品置于10 mL容量瓶内，分别滴加35%的浓盐酸3滴静置2.5 h，或滴加6 mol·L－1的NaOH溶液3滴静置1.5 h，或滴加30%双氧水5滴加热1 h，之后各样品加入流动相稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样，作为酸、碱、氧化破坏溶液。称取4 mg施普睿达供试品置于10 mL透明容量瓶，在光照（4500±500）Lx下放置20 d后，加入流动相稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为光破坏溶液。取上述5种溶液进样分析，结果表明，各种条件下降解产物与施普瑞达分离度良好。各溶液色谱见图2。

图2 施普瑞达降解产物高效液相色谱图A.高温破坏溶液；B.酸破坏溶液；C.碱破坏溶液；D.氧化破坏溶液；E.光破坏溶液；1.施普瑞达Fig 2 HPLC chromatogram of degradation products of SpridaA.treated with high temperature；B.treated with acid；C.treated with alkali；D.treated with oxidation；E.treated with light；1.Sprida

2.4 线性范围

精密量取对照品溶液5.0、2.0、1.0、0.5、0.1、0.1 mL分别置于10、10、10、10、10、25 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得一系列对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下测定，记录色谱。以施普睿达浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝4×106X+1756.8（R2＝0.9999）。结果表明，施普睿达检测浓度线性范围为0.004～0.5 mg·mL－1。

2.5 最低检测限

取对照品溶液适量加流动相稀释成一定浓度的溶液，测定，以信噪比3倍计算的施普睿达的最低检测限为8 ng；以信噪比10倍计算的施普睿达的最小定量限20 ng。

2.6 精密度试验

取对照品贮备液5 mL，置于10 mL容量瓶内，加流动相稀释至刻度，按上述色谱条件，重复进样6次，测定施普睿达峰面积，计算其RSD＝0.23%。

2.7 溶液稳定性试验

取供试品溶液2 mL，置于10 mL容量瓶内，加流动相稀释至刻度，同时，在24 h内每2 h进样1次测定，记录峰面积并计算得RSD＝0.45%。结果表明该供试品溶液稳定，能满足测定要求。

2.8 重复性试验

取同一批施普睿达供试品分6次取样，精密称定5 mg，加流动相溶解并稀释成0.5 mg·mL－1溶液，按上述色谱条件测定，6次测定结果的含量平均RSD值为2.63%，结果表明该法重复性好。

2.9 回收率试验

精密量取1 mg·mL－1供试品1 mL，共10份，置于10 mL容量瓶中，分别精密量取对照品（1 mg·mL－1）贮备液0.5、1、1.5 mL各3份，置于加入供试品的容量瓶内，加流动相稀释至刻度，按上述色谱条件测定。测得样品峰面积，求得回收率，结果其平均回收率为100.0%，RSD＝1.25%，详见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.10 样品含量测定

在上述色谱条件下，精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样，记录色谱，按外标法以峰面积计算供试品的含量。结果，批号为2009316、2009319、2009409的施普瑞达标示含量分别为99.20%、95.30%、97.54%。

3 讨论

本试验曾考察了组成为冰醋酸-乙腈，以及不同浓度、不同pH的磷酸盐缓冲液-乙腈组成的流动相系统的色谱行为，最后确定本文所用的流动相，并证实在该条件下所得色谱峰形好，分离度符合要求；同时，所选用的色谱柱普遍、通用，方便推广。

[1]洪 阁，刘培勋.槐属植物生物碱化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2005，36（5）：783.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录172.