奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对四环素耐药性分析

丁兆凤，汤 炜，佟春玉,，陈龙欣，周 雪，徐菲一，朱战波，崔玉东,*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

奶牛乳房炎是造成养牛业重大的经济损失的一种多发病。研究证实，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎最主要的致病菌[1]。四环素是治疗细菌感染的常用药，但耐药性问题不容忽视[2]。S.aureus对四环素的耐药性一直是人们关注的问题，近几年来有关人医的耐药性研究较为广泛，但牛源S.aureus四环素耐药性研究的报道甚少。本实验对奶牛乳房炎中分离的26株S.aureus四环素耐药性进行研究，为了解对四环素耐药机制和有效防控牛源性S.aureus感染提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株S.aureus分离株：HLJ1、HLJ3、HLJ4、L5-2、HS-2、HS-4、Z1、Z3、Z4、AT、ZJK-1、HLJ23-1、WH-1、SH-1、SH-3、SH-4、SH-5、SH-6、SH-7、SH-8、SH-10、SH-11、SH-12、SH-14、SH-17和SH-18为近年来从湖北、河北、天津、内蒙古、黑龙江等地区牛场乳房炎病牛奶样中分离获得，由本实验室保藏。参考菌株：S.aureusATCC25923和ATCC29213购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 主要试剂 TSB培养基购自BD公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、DNA Marker购自北京全式金公司；MHA琼脂和MH肉汤培养基购自青岛海博生物公司；利血平购自Sigma公司；四环素药敏纸片(30 μg)购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 四环素耐药表型检测 采用NCCLS推荐的K-B纸片扩散法(Kirby-Bauer)和常量肉汤法测定MIC值，以S.aureusATCC25923和ATCC29213为质控菌株。试验操作及结果判定均参照美国临床试验室标准化委员会(NCCLS)2003年版标准[3]。

1.4 抑制剂的逆转试验 制备含有泵抑制剂利血平和四环素的MH肉汤待用(利血平的终浓度为20 μg/mL)，以测定其是否对四环素药物的体外抗菌活性有影响。结果判定标准：含利血平的肉汤中测定的MIC值比单独使用药物时相应的MIC值降低4倍或4倍以上表明有主动外排机制的存在[4]。

1.5 四环素耐药基因tetK、tetL、tetO和tetM的扩增 根据GenBank登录的S.aureus中常见的4种四环素耐药基因tetK、tetL、tetO和tetM的序列，应用DNAStar软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成(表1)。采用蛋白酶K法提取基因组DNA作为扩增模板[5]。

1.6 PCR产物克隆测序及序列分析 PCR产物用小量胶回收试剂盒回收目的片段并与pEASY-Blunt载体连接，转化到感受态细胞E.coliTrans-T1中，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确的阳性克隆由上海桑尼生物科技有限公司测序。测序结果应用BLAST和DNAStar软件进行分析。

表1 基因引物表Table 1 Primers used in this study

2 结果与讨论

2.1 四环素耐药表型检测 根据2003年NCCLS标准判定K-B法和MIC值测定结果：26株奶牛乳房炎S.aureus中有7株对四环素耐药，耐药率达26.9%，19株对四环素敏感，无疑似菌株(表2)。该结果比Vintov等在欧洲和美洲10多个国家分离的奶牛乳房炎S.aureus中四环素耐药的平均检出率为1.5%[6]，2004年Shitandi等报道的检出率为5.5%[7]，本实验结果与张忠厚报道的24.8%相近[8]。检测结果显示，我国四环素耐药情况比国外严重，表明我国抗生素使用不够规范，耐药率高于国外，同时反映出随着用药时间延长，S.aureus四环素耐药菌株有增多的趋势。

2.2 泵抑制剂的逆转试验 在利血平存在的情况下，7株耐药菌株中HLJ1的MIC值从64 μg/mL下降至32 μg/mL；6株耐药菌株的MIC值从16 μg/mL下降至2 μg/mL，下降了7倍。有6株菌株经泵抑制剂检测证实为外排机制介导引起四环素耐药。由外排机制介导的耐药菌株中，添加泵外抑制剂后耐药菌株均由耐药表型变为敏感表型，表明在使用四环素作为治疗药物时，联合使用泵外抑制剂能增强对四环素的敏感性，为临床使用四环素药物治疗S.aureus感染提供参考。

2.3 四环素耐药基因PCR扩增 四环素耐药基因有30余种，常见的耐药基因为tetK、tetL、tetM和tetO，tetK和tetL编码外排蛋白，tetM和tetO编码核糖体保护蛋白。本实验对26株菌株的tetK、tetL、tetM和tetO进行检测，仅在耐药菌株中扩增出tetK或tetM(图1、图2)，未检测到tetL和tetO；在敏感菌株中未扩出耐药基因。在6株MIC值为16 μg/mL的耐药菌株中均检测出tetK基因，在1株MIC值为64 μg/mL的耐药菌株中检测出tetM基因。证实核糖体保护蛋白基因介导耐药的MIC值要高于外排基因介导耐药的MIC值，属于高水平耐药。在添加利血平所引起MIC值下降7倍的菌株中，均扩增出外排基因tetK，表明外排机制和基因检测结果相符。国内仅代敏等在奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌中检测出tetM基因的报道[9]，同时，本实验于国内首次从奶牛乳房S.aureus中检测到tetK基因(检出率为23.07%)，检出率高于tetM基因(3.84%)，表明在我国奶牛乳房炎S.aureus对四环素的耐药机制中，不仅有核糖体保护机制，也存在外排机制。

表2 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌四环素耐药表型测定结果Table 2 The tetracycline resistance of Staphylococcus aureusisolates from cow mastitis

图1 tetK基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR product of tetKgene

2.4 tetK和tetM的基因序列及氨基酸序列分析tetK基因与S.aureus质粒pT181同源性为100%，tetM基因与转座子Tn916同源性达99.9%。tetM基因与参照基因Tn916相比，在第962位发生T碱基缺失，使氨基酸在第321位由亮氨酸变为终止密码子。Chopra等对8种不同来源的teM基因进行比较，发现上游序列的同源性为96%～100%[10]，下游序列却有较大差异，从而认为上游序列对调控极为重要。根据Chopra等的推论，是否第321位以后的氨基酸对tetM蛋白在S.aureus体内的活性无影响，还有待进一步验证。

图2 tetM基因的PCR扩增结果Fig.2 PCR product of tetMgene

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