净肤液抗人乳头瘤病毒的实验研究

向宏社,何俊清

1.巴东县清太平镇卫生院(湖北 巴东 444321)

中成药净肤液为恩施州中心医院自制制剂，全方合用，具有消炎、抗病毒、杀灭疣体以及抗复发等作用。作者通过长期临床观察，将净肤液作为治疗尖锐湿疣的辅助治疗药物，起到了很好的临床治疗作用[1]。为了进一步探讨其抗病毒作用的机制，本实验对净肤液进行了抗病毒感染的体外实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 净肤液 净肤液由湖北省恩施州中心医院中医副主任医师何俊清主持的恩施州科技项目，采用苦参、黄柏、川椒、地肤子、土茯苓、大黄、百部、千里光、甘草等为主选药组方，加水煎煮浓缩而成的中药外用熏洗制剂(1.0 g/ml)。

1.1.2 病毒 HPV病毒由恩施州中心医院皮肤科采集于尖锐湿疣(CA)患者外阴部位的疣体标本。

1.1.3 试剂与仪器 2.5%氟尿嘧啶乳膏(珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，批号：20050412) ；ABI PRISMTM7700荧光定量PCR仪(美国PE公司)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；GNP-9080型恒温培养箱(南京实验仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 抗尖锐湿疣病毒实验

1.2.1.1 CA混悬液的制备 将CA患者外阴部位的疣体标本(经鉴定为HPV6/Ⅱ型)，匀浆后加入生理盐水，配成一定浓度的离体CA混悬液。

1.2.1.2 样品作用疣体的方法 实验分四组，即空白基质组、生理盐水组、净肤液组和氟尿嘧啶软膏治疗组，每组设4个重复。空白基质组取CA混悬液和蒸馏水各25 μl至1.5 ml离心管中，生理盐水组取CA混悬液和生理盐水各25 μl至1.5 ml离心管中，净肤液组取净肤液和CA混悬液各25 μl至1.5 ml离心管中，氟尿嘧啶软膏治疗组取2.5%氟尿嘧啶软膏和CA混悬液各25 μl至1.5 ml离心管中。分别在样品作用疣体2、4、6 d后取样，进行HPV-DNA的提取。

1.2.1.3 HPV-DNA的提取 从温浴箱中取出经样品作用的CA混悬液，加入DNA提取液，提取得HPV-DNA作扩增模板。

1.2.1.4 DNA扩增 加入试剂盒中一定量的PCR反应液、Taq DNA聚合酶、UNG和HPV-DNA模板于扩增反应管中，置入定量PCR仪中。设置程序为：37℃，5 min；94℃，1 min；95℃，5 s；60℃，30 s，循环40次。HPV-DNA经高温变性、低温退火及延伸进行循环扩增。

1.2.1.5 定量方法及建立标准曲线 按文献[2]HPV-DNA扩增后经荧光探针检测扩增数量，另取试剂盒中5个浓度的HPV-DNA定量阳性标准品(5×108/ml，5×107/ml，5×106/ml，5×105/ml，5×104/ml)，同上法扩增及荧光检测，以起始拷贝数的自然对数为横坐标、循环阈值为纵坐标，得到的回归直线为标准曲线(r=0.9990)，据此对样品的扩增数量进行定量。

1.4结果抗CA病毒实验的结果见表1。经净肤液作用2 d后，病毒数明显减少；作用4 d后PCR结果即为阴性，说明对病毒有明显破环作用，抑制其复制扩增；2.5%氟尿嘧啶软膏作用2 d后，其病毒数亦明显减少，到作用4 d后PCR结果即为阴性；而空白基质、生理盐水的阳性结果表明其对病毒没有影响。

表1 净肤液不同时间对HPV-DNA的作用(n=5)

2 讨论

人乳头瘤病毒是一种致尖锐湿疣的DNA病毒，近年来，尖锐湿疣发病率逐年上升，已位于性传播疾病第二位，它是由人乳头瘤病毒引起的良性增生，病变侵犯区域仅限于表皮粘膜，不突破基底层，病理表现类似于鳞癌。人类又是它的唯一宿主[3，4]，故难以采用动物模型法进行治疗药物的药效学试验。笔者采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术进行其体外抗病毒药效学试验，通过定量检测经药物作用后的HPV-DNA的扩增数量，从而考察净肤液对离体CA皮损组织的抗病毒作用，结果显示净肤液对人乳头瘤病毒具有明显的破坏作用，其作用机制是通过抑制人乳头病毒DNA复制，而对尖锐湿疣产生明显的治疗效果。有文献报道[5，6]食疗及中药干预可迅速恢复脏腑功能的协调，纠正人体免疫缺陷，干扰病毒复制，增强细胞免疫因子杀死病毒，从而达到全面排毒、标本兼治的目的。净肤液为中成药复合制剂，在此方中，苦参清热燥湿、祛风杀虫，常用于治疗疥癣、阴痒之症；黄柏清热燥湿泻火，常用于治疗带下湿痒、火毒痈疮等；川椒专攻杀虫；地肤子祛湿止痒，常用于治疗疥癣、皮肤瘙痒、带下等；土茯苓清热解毒力强，为治梅毒症之要药；大黄清热、破瘀消肿、杀虫止痒；百部杀虫止痒，常于于治疗阴痒、疥癣、虫证等；千里光清热、去腐生肌，常用于治疗皮肤瘙痒症；甘草调和诸药，有清热解毒功效。

综上所述，净肤液对人乳头瘤病毒具有明显的破坏作用，为净肤液抗病毒作用及杀灭疣体提供了理论依据，也为净肤液的临床推广应用提供了更加确实的实验数据。

[参考文献]

[1] 何俊清，雷淑英，张世福.净肤液熏洗配合冷冻治疗尖锐湿疣80例[J].湖北中医杂志，2002，24(10)：45.

[2] 孙静，陈曲波，张林林，等.乙肝标志物模式与HBV-DNA定量的比较分析[J].现代中西医结合杂志，2002，11(8)：750-753.

[3] 张华，李秉煦.人类乳头瘤病毒感染的局部用药[J].中国医院药学杂志，2006，26(2)：202-203.

[4] M1akar B．Anoscopy could be beneficial for women with external anogenital condy1oma[J].Eur J Obstet Gyneco1 Reprod Biol,2007,133(1)：121-122.

[5] 陈筱波，黄舜蓓.食疗及中药综合干预对高危型人乳头瘤病毒阴转疗效分析[J].现代实用医学，2010，22(7)：801-802.

[6] 赵银玲，叶丽华，徐桂香.中西医结合治疗宫颈糜烂合并持续高危型人乳头瘤病毒感染的临床分析[J].中国现代医生，2010，48(20)：57-61.