山地乌骨鸡不同组织中CAPN 1基因表达的发育性变化

肖 蔹 ，张增荣 ，黄 毅 ，刘益平 ，朱 庆

（1.四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637100）

本试验以四川山地乌骨鸡为研究对象，利用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法，以鸡CAPN 1基因的定量研究为切入点，阐明CAPN 1基因对肌肉嫩度的作用机制。通过分析钙蛋白酶系统与鸡肉质密切相关的功能基因（CAPN 1基因）在不同组织的表达差异，探索CAPN 1基因表达的发育性变化规律，为进一步研究该基因对优质肉鸡嫩度的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和采样 以四川农业大学培育的山地乌骨鸡品种为试验对象。试验鸡只数量500只，鸡群在相同条件下饲养，分别于 1d、14d、28d、42d、56d、70d和84d每个时间段屠宰6只。屠宰后取胸肌、腿肌、肝脏、心、大脑组织样品，置于液氮中带回实验室，于-70℃冰箱中保存，用于总RNA提取。然后进行荧光实时定量PCR，分析组织CAPN 1 mRNA丰度。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计 参照荧光实时定量PCR SYBR GreenⅠ法引物设计要求，根据鸡CAPN 1的DNA序列（GenBank 登录号∶NC_006090.1），鸡 Beta-actin基因（内参）全序列（Genbank登录号：NC_006090.1），利用Oligo6.0软件设计鸡CAPN 1、Beta-actin基因特异引物。CAPN 1引物为 F：5′-GCCAACAGAGAGAAGA TGACAC-3′，R：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，扩增目的片段长度为116bp，退火温度57℃；Beta-actin引物为 F∶5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′；R∶5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′，扩增目的片段长度为140bp，退火温度57℃。

1.3.2 总RNA的提取和反转录 总RNA提取按Trizol Reagent Kit提供的方法进行,并采用紫外分光光度计检测浓度和纯度（OD260/OD280=1.8～2.0）。使用SYBRRPrime ScriptTMRT-PCR Kit中的反转录反应试剂合成cDNA，反应试剂和条件见试剂盒说明书。

1.3.3 样品的实时荧光定量PCR检测

1.3.3.1 构建标准曲线 RT-PCR产物用Gel Extraction Mini Kit回收，经测序确认后10倍体系稀释，用于构建标准曲线。取1μL稀释10-3倍再逐级稀释至10-10倍，以稀释后的PCR产物作模板，按照定量PCR反应体系进行PCR扩增构建标准曲线。每例样品及阴性对照均设3个平行复孔，取均值。反应结束后，由电脑自动得出荧光反应曲线。

1.3.3.2 反应体系及条件 利用反转录合成的cDNA分别做目的基因（CAPN 1）PCR和内参基因（Betaactin）的定量PCR。根据所设计合成的目的基因和内参基因上游、下游引物给定的Tm值优化退火温度。实时定量 PCR反应体系为 25 μL，其中SYBRRPremix EX TaqTM（2×）12.5 μL、cDNA 2.0μL、上游引物（10μM）0.5μL、下游引物（10μM）0.5 μL、dH2O 9.5 μL。每个样品设置3个重复，于实时定量PCR仪上进行PCR扩增。反应程序：95℃ 3min热启动HotStar Taq酶活性；94℃ 5s、57℃ 30s，共50个循环；95℃ 1min、55℃ 1min，55～95℃每 30s升高 0.5℃（共 81个循环）进行溶解曲线分析，16℃保存。阴性对照以无RNA酶的水代替cDNA模板。反应结束后，由电脑自动得出荧光反应曲线。

1.4 数据处理 利用Excel 2003统计各样品Ct值，参照Kenneth（2001）的方法计算目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数。

其中，Rel.Quantity表示目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；GOI表示目的基因；NORM表示内参基因；Eff表示PCR扩增效率。

利用SPSS12.0 For Windows软件进行数据统计分析，荧光实时定量PCR结果均用均值±标准差（Means±SD）表示，CAPN 1基因各相对表达量的差异用One-way ANOVA（单因素方差分析）进行分析，并进行Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 CAPN 1和Beta-actin基因RT-PCR扩增结果 以山地乌骨鸡总RNA为模板，用所设计的CAPN 1和Beta-actin引物分别进行RT-PCR扩增，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别获得116bp和140bp的条带。两个基因扩增产物条带清晰、明亮、无杂带，说明可以利用这两对引物进行实时荧光定量PCR。测序结果与GenBank所提供序列的一致性达100%，为目的基因片段。

2.2 目的基因与内参基因的标准曲线和溶解曲线CAPN 1基因标准曲线在模板浓度梯度为10-3～10-10的范围内构建，对应Ct值为9.34～30.99，标准曲线为：Y=-3.321X+2.658，一致系数 R2=0.988，Eff=100%；Beta-actin基因标准曲线在模板浓度梯度为10-3～10-10的范围内构建，对应Ct值为6.34～28.34，标准曲线为：Y=-3.564X-4.006，一致系数 R2=0.981，Eff=90.8%。其中，Y为Ct值，X为模板量的对数值。两条标准曲线的扩增效率在理想的90%～105%范围内。

2.3 相对定量PCR结果

2.3.1 山地乌骨鸡CAPN 1 mRNA的组织表达差异以各时间点腿肌平均Ct值为对照，计算各组织CAPN 1基因的相对表达量（表1）。结果表明：除了1d、28d两个时间点以外，5个组织中的基因表达量均为肌肉（腿肌、胸肌）＞心＞脑＞肝。多重比较结果显示：在1d、14d，腿肌显著高于肝（P＜0.05）；在28d，胸肌极显著高于其他各组织（P＜0.01），心极显著高于脑、肝（P＜0.01），腿肌极显著高于肝（P＜0.01），腿肌显著高于脑（P＜0.05）；在 42d，胸肌极显著高于肝、心、脑（P＜0.01），显著高于腿肌（P＜0.05）；在 56 d，胸肌极显著高于肝（P＜0.01），显著高于脑（P＜0.05），腿肌显著高于肝（P＜0.05）；在70 d，胸肌极显著高于肝、心、脑（P＜0.01），腿肌显著高于肝、脑（P＜0.05）；在 84 d，腿肌极显著高于肝（P＜0.01），显著高于心、脑（P＜0.05），胸肌显著高于肝（P＜0.05）。

表1 四川山地乌骨鸡5个组织CAPN 1基因的相对表达量 倍

2.3.2 山地乌骨鸡CAPN 1 mRNA在不同组织中的发育性表达 山地乌骨鸡的5个组织在各时间点其CAPN 1 mRNA的相对表达量均以84 d样品平均Ct值为对照（表2）。结果表明：腿肌中CAPN 1基因的表达量在42d前变化很小，随后逐渐升高，在52 d达到较高表达量，70d有所回落，最后在84d达到最高点，其中84 d极显著高于其他各时间点（P＜0.01），56 d显著高于 1 d、42 d（P＜0.05）；胸肌组织中 CAPN 1 基因的表达规律和腿肌组织中该基因的表达规律基本一致，随着日龄增加而上升并在84 d达到最高点，但在42 d和70d有所回落，其中84d、56d显著高于1d（P＜0.05）；肝脏组织在1d最低，42d最高，各时间点间差异不显著（P＞0.05）；心在1d最低，28d最高，各时间点间差异不显著（P＞0.05）；脑在 42d最低，56 d最高，各时间点间差异不显著（P＞0.05）。

表2 四川山地乌骨鸡5个组织中CAPN 1基因的发育性变化 倍

3 讨论

本试验所采集的山地乌骨鸡的胸肌、腿肌、心、脑、肝组织样本中（1～84d），均检测出CAPN 1基因表达，且表达量较高（Ct值在20.65～30.4之间），这进一步证实了该蛋白酶在鸡细胞内是普遍存在的，并参与机体的生长与代谢过程。

通过对不同时间点内的表达量进行比较分析可以看出，除了1日龄和28日龄，其余各时间点肌肉组织（胸肌和腿肌）均为优势组织，5个组织中的基因表达量均为肌肉（腿肌、胸肌）＞心＞脑＞肝。Ilian利用核糖核酸酶保护法定量测定CAPN 1基因mRNA在牛和羊各组织中的表达量，得出：骨骼肌＞心＞肝。刘安芳等利用半定量RT-PCR的方法，检测了4个品种鸡的10个组织中均有CAPN 1基因mRNA的表达，其中胸肌＞肝＞脑＞心。不同试验结果虽有所差异，但均发现在肌肉组织中为高表达，证实了该基因可能是影响鸡肌肉增长和嫩度的主效基因或与主效基因连锁。

Morgan等研究认为，CAPN 1是肉嫩化的基本酶类，钙蛋白酶体系是导致蛋白质降解、嫩度提高的关键酶，CAPN 1基因表达量与肌肉嫩度的关系呈正相关。大量资料报道表明：肌纤维直径越小、密度越大，肉质就越嫩。在优质肉鸡研究中我们发现，随着日龄增加其纤维直径逐渐变大、密度逐渐降低，尤以56～84d变化明显。本试验在研究各组织发育性表达中，发现胸肌和腿肌的发育性模式非常相似：CAPN 1基因表达量在42 d后随着日龄增加有增长的趋势。在鸡发育中后期肌肉相对增长减小，单位面积内的肌纤维直径也变小，相应的肌纤维密度增大，而肌肉密度与肌肉嫩度是呈正相关的，由此得出CAPN 1基因在肌肉组织中的表达量与鸡肌肉组织的生长发育呈相似的变化规律。

5 结论

本试验采用实时定量方法首次测定了CAPN 1基因在山地乌骨鸡5个组织中的相对表达量，获得了该基因在各组织中的表达规律，结果表明：CAPN 1基因在各阶段均有表达，且表达具有组织差异性，肌肉组织为优势组织；CAPN 1基因在肌肉组织中的表达量与鸡肌肉组织的生长发育呈相似的变化规律。

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