康宁木霉诱变菌株产酶条件的研究

刁彩霞，甘文平，麻名汉

（黑龙江省农垦科学院畜牧特产所，哈尔滨 150038）

纤维素是地球上数量最大的可再生资源，微生物对其降解、转化是自然界中碳元素转化的主要环节。纤维素的生物转化与利用对解决当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要意义。近年来，我国对纤维分解菌的应用研究十分活跃，已筛选出具有独特的纤维素分解作用的高产菌株，其在长期保存新鲜秸秆营养成分的同时，可降低纤维素、半纤维素、木质素的含量，不仅适口性好，保存期长，而且操作简便，成本低，为粮食主产区发展畜牧业提供了广阔的饲料资源[1-9]。

为此，本研究小组开展了混合菌株在东北地区主要农作物玉米秸秆和稻草上的应用研究，本文主要对2株产纤维素酶较高的黑曲霉菌株和康宁木霉菌株进行了产酶效果的比较研究，并进一步摸索了培养条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试剂：水杨素、羧甲基纤维素钠；试验中所用其他试剂均为分析纯。

菌种及培养基：黑曲霉（Aspergillitus niger）jg1、康宁木霉（Trichoderma koningii）jg2由本研究室保藏。

斜面培养基：黑曲霉jg1采用PDA培养基，康宁木霉jg2采用麦芽汁琼脂培养基。

三角瓶培养基：黑曲霉：稻草粉 50 g·L－1、麦麸 10 g·L－1、（NH4）2SO410 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1。康氏木霉培养基中含稻草粉 50 g·L－1、麦麸10 g·L－1、牛肉蛋白胨 5 g·L－1、起始 pH 5.0。

诱变初筛培养基：CMC-Na 2 g·L－1，牛肉蛋白胨 5 g·L－1，琼脂 14 g·L－1，刚果红 0.2 g·L－1，脱氧胆酸钠 10 g·L－1，pH 5.0。

1.2 试验方法

将黑曲霉和康宁木霉菌种接种于斜面培养基上，28℃培养4～6 d后使用或在4℃下保存，250 mL三角瓶装发酵培养基50 mL，121℃灭菌20 min，接种用生理盐水冲洗的孢子1mL（孢子数107个·mL－1），28 ℃ 在 120 rpm 摇床上振荡培养168 h，离心上清液即为粗纤维素酶液。

pH用酸度计测定。纤维素、半纤维素和木质素的测定参考王建兵的方法[10]。残余还原糖的测定采用DNS法。

酶活力的测定采用CMC酶活性测定方法，取适当稀释的酶液0.5 mL，加入1%的CMC溶液（溶于 pH 4.8 的 0.1mol·L－1HAc-NaAc缓冲液中）1mL，50℃ 保温 30 min，加入 DNS试剂3 mL，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，在520 nm处测还原糖。滤纸酶活力的测定：取适当稀释的酶液0.5 mL，加入缓冲液（pH 4.8 的 0.1 mol·L－1HAc-NaAc）1mL中，并加入1条1×6 cm的滤纸，500℃保温1 h，加入DNS试剂3mL，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，在520 nm处测还原糖。β-葡萄糖苷酶活力测定：取适当稀释的酶液0.5mL，加入1 mL质量分数为 1%的水杨素溶液（溶于pH 4.8的0.1mo1·L－1HAc-NaAc缓冲液中）。50 ℃ 保温30min，再加入DNS试剂3mL，沸水浴5min，冷却后加水稀释到 25 mL，在 520 nm处测还原糖。

2 结果与分析

2.1 受试菌种产纤维素酶能力的比较

以秸秆为主要碳源，对受试菌种三角瓶产纤维素酶的水平进行了反复比较，结果见表1。

表1 受试菌种产酶能力的比较

由表1可见，康宁木霉jg2产酶较高，残余还原糖较少，故选用康宁木霉jg2进行后续研究。

2.2 康宁木霉jg2诱变前后产酶能力的比较

为了提高康宁木霉产纤维素酶的能力，对其进行了紫外线和硫酸二乙酯（DES）复合诱变，经初筛、复筛获得了诱变菌株jg4，其产酶能力情况见表2。

由表2可见，经诱变后各组分均有一定程度的提高，由硫酸二乙酯诱变后的菌种为康宁木霉jg4，在麦芽汁琼脂培养基上传代5次，每代进行发酵酶活力测定，发现产酶能力没有大的变化，说明其遗传稳定性较好，故以此菌种进行后续试验。

表2 康宁木霉jg2经诱变后产酶能力的变化

2.3 不同碳源对康宁木霉jg4产酶的影响

分别以稻草粉、秸秆粉、麦麸（均过80目筛）取代发酵培养基中的碳源，研究了碳源对产酶的影响，结果见表3。

由表3可见，康宁木霉jg4以稻草为碳源的酶活力最高，其次是秸秆，麦麸最低。

表3 不同碳源对康宁木霉jg4产酶的影响

2.4 不同氮源对康宁木霉jg4产酶的影响

选取常用的氮源：豆饼、蛋白胨、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、尿素为研究因素，比较不同氮源对康宁木霉jg4产酶的影响，结果见表4。

由表4可见，无机氮对康宁木霉jg4产酶的影响优于有机氮，氨态氮优于硝态氮，（NH）4SO4为氮源时 CMCCase、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶活力皆最高，残余还原糖量也处于较低的水平，这一结果与李爱华等的试验结果一致[11]。因此，本研究选用（NH）4SO4作为氮源。

表4 不同氮源对康宁木霉jg4产酶的影响

2.5 通气量对康宁木霉jg4产酶的影响

250 mL三角瓶装填不同体积的培养基，进行产酶试验，结果见表5。

由表5可见，250mL三角瓶装30～60 mL培养基均能获得较佳的产酶效果，但随着装液量的继续增加，产酶水平逐渐下降，这可能是由于供氧不足，不利于康宁木霉的生长。本试验选择了40mL培养基。

表5 通气量对康宁木霉jg4产酶的影响

2.6 培养温度对康宁木霉jg4产酶的影响

培养温度对康宁木霉jg4产酶也有很大的影响，本研究选择了不同温度进行发酵试验，结果见表6。

从表6可见，30℃产酶水平最高，较低温度对康宁木霉jg4产酶不利，可能是因为较低温度会影响菌丝体的生长。

表6 培养温度对康宁木霉jg4产酶的影响

2.7 接种量对康宁木霉jg4产酶的影响

试验用孢子悬浮液，孢子为麦芽汁琼脂斜面培养4～6 d后，用生理盐水充分冲洗得到，用不同体积的孢子悬浮液接种见表7。

由表7可见，接种量对产酶影响不大，本研究选择接种2mL抱子悬浮液、30mL发酵培养基。

2.8 培养时间对康宁木霉jg4产酶的影响

根据上述试验结果，选择三角瓶发酵培养基：稻草2.4 g，麦麸1.2 g，（NH4）2SO41%，装液量40mL，转速140 rpm，培养温度30℃，每 12 h取 1次样，研究残余还原糖及纤维素酶活力的变化，结果见图1、2。

从图1可见，在发酵过程中，由于菌体生长消耗，残余还原糖先下降，随后上升，说明康宁木霉产生了水解酶，将麦麸和稻草粉降解为还原糖，但随着发酵的进行，还原糖会逐渐被菌体消耗而下降。

表7 接种量对康宁木霉jg4产酶的影响

图1 摇瓶发酵过程中残余还原糖变化

图2 摇瓶发酵过程中FPA, β-葡萄糖苷酶，CMC酶活力的变化

从图2可见，康宁木霉jg4发酵过程中CMC酶活曲线有两个峰值，36 h时CMC酶活力出现第1个高峰，酶活力达80.45 U·mL－1，随后缓慢下降，其最高峰值出现在132 h，随后缓慢下降；滤纸酶活力和β－葡萄糖苷酶活力也在132 h出现峰值。

3 结 论

本研究发现，培养基组成和培养条件对康宁木霉jg4产酶均有显著影响，当以稻草粉和秸秆为主要碳源时，有利于康宁木霉jg4发酵产酶，这表明其产酶为诱导酶，在试验中氮源选用硫酸铵较好，说明康宁木霉jg4利用无机氮的能力较强。试验表明，康宁木霉jg4液体摇瓶发酵培养基为：稻草粉 50 g·L－1，麦麸 10 g·L－1，硫酸铵 10 g·L－1，装液量40mL，pH自然。发酵条件为：培养温度30℃，转数120 rpm，培养时间为132 h。

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