氯沙坦对心力衰竭大鼠心肌细胞 Bax、Bcl-2蛋白表达的影响△

四川泸州医学院附属医院儿科(泸州 646000) 陈书琴 杜 娟 朱红枫

近年来的研究证实,心力衰竭(Heart failure,HF)是心血管疾病的终末阶段的临床表现,心肌细胞凋亡是 HF发生发展的一个重要的病理生理基础,通过阻断、干预凋亡去治疗 HF的认知得到迅速发展。王志坚等[1]研究发现心力衰竭患者血浆 ET-I、AngⅡ浓度明显升高,氯沙坦具有降低 ET-1的作用。本实验通过建立心力衰竭模型,采用 TdT介导的 dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)判定心肌细胞凋亡,并采用免疫组化方法研究心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡调节蛋白 Bax、Bcl-2的表达,探讨氯沙坦对心力衰竭时心肌细胞凋亡的影响及其在积极逆转心肌受损,改善心衰进程中的作用。

材料与方法

1 动物与试剂 8周龄健康、雄性 SD大鼠 24只由泸州医学院动物实验中心提供;盐酸阿霉素(Adriamycin,ADR)由浙江海正药业股份有限公司生产,氯沙坦由杭州默沙东制药有限公司生产;TUNEL试剂盒(原位细胞凋亡检测试剂盒)为德国 Roche公司生产;Bax试剂盒,Bcl-2试剂盒,DAB显色剂为北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型制作 将 24只大鼠随机分为 3组:对照组、心衰组、氯沙坦干预组各 8只。参照《现代医学实验动物学》将盐酸阿霉素粉针用灭菌注射用水溶解,心衰组:腹腔注射 ADR(4 mg/kg,每周 1次,共 6周,累积总量 24 mg/kg;氯沙坦干预组腹腔注射 ADR 4 mg/kg,同时每天给氯沙坦 20 mg/kg灌胃,对照组:注射相同体积的注射用水。

2.2 心肌石蜡切块的制备 末次给药 24 h,取出心脏洗净固定 12 h,二甲苯透明,石蜡包埋,切片用以检测心肌细胞凋亡及 Bax与 Bcl-2基因的蛋白表达检测。

2.3 心肌细胞凋亡指数检测 用 TUNEL法,按试剂盒说明操作,以细胞核被染成棕褐色为阳性结果。每个标本观察凋亡阳性细胞,计算平均阳性细胞百分数。按公式:凋亡指数(AI):凋亡细胞核数 /总细胞核数计算。

2.4 Bax、Bcl-2蛋白表达的检测 石蜡切片脱蜡水化,PBS漂洗,滴加正常羊血清室温下封闭,弃去羊血清,滴加一抗;PBS漂洗,滴加生物素化二抗(1∶100);PBS漂洗,链霉素-生物素化 HRP复合物(1∶100);PBS漂洗,Tris-HCl缓冲液漂洗,DAB显色后漂洗;苏木素淡染,脱水,透明,中性树胶封片,镜检。阴性对照以 PBS代替一抗孵育,其他步骤相同;阳性对照用已知的阳性标本。

2.5 计算机图像分析 用计算机图像分析系统(IPP6.0)进行定量分析,测定阳性染色的平均光密度(MOD)与阳性细胞百分比(指阳性细胞占视野中所有细胞数的百分比),分析心肌组织中 Bcl-2,Bax蛋白阳性染色面积百分数。蛋白阳性表达指数(PEI):PEI(%)= MOD×阳性细胞百分比×100%。

3 统计学处理 各组之间指标的比较用SPSS13.0软件包进行秩和检验,以 P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 各组心肌细胞凋亡指数检测结果 见表 1。对照组心肌细胞凋亡指数均比其他各组低,而心衰组心肌细胞凋亡指数较氯沙坦干预组高,提示氯沙坦有抑制心肌细胞凋亡的作用。

表1 各组心肌细胞凋亡指数的比较(±s)

表1 各组心肌细胞凋亡指数的比较(±s)

注:与对照组比较,*P＜0.01;与心衰组比较,△P＜0.01

组 别 n 心肌细胞凋亡指数对照组 8 0.92±1.64心衰组 8 22.28±5.32*氯沙坦干预组 8 13.49±7.45△H值 19.86 P值 0.000

2 Bax和 Bc1-2基因蛋白表达结果 见表 2。心衰组和氯沙坦干预组心肌细胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01),与心衰组相比,氯沙坦干预组明显下调 Bax基因表达,上调 Bc1-2基因表达(P ＜0.01)。

表2 各组心肌细胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表达的PEI比较 (± s)

表2 各组心肌细胞 Bax和 Bc1-2基因蛋白表达的PEI比较 (± s)

注:*与对照组比较,P＜0.01;△与心衰组比较,P＜0.01

组 别 n Bax Bc1-2对照组 8 0.53± 0.07 0.69± 0.11心衰组 8 17.92± 9.81* 5.39± 0.64*氯沙坦干预组 8 8.32± 11.06△ 10.49± 7.59△H值 18.24 18.17 P值 0.000 0.000

讨 论

实验研究[2]发现:ADR具有严重的心脏毒性作用,采用连续腹腔注射 ADR,可使心肌细胞变性坏死,降低心功能并出现 CHF。本实验研究表明,心衰组心肌细胞凋亡指数较对照组升高,证明了 HF时心肌细胞存在凋亡。而氯沙坦干预组心肌细胞凋亡指数比心衰组降低,这表明氯沙坦具有降低心肌细胞凋亡,保护HF的作用。与陈源源等[3]报道结论一致。

细胞凋亡受多种基因调控,这一过程受多种促凋亡和抗凋亡的蛋白调节,其中促凋亡基因 Bax和凋亡抑制基因 Bc1-2被认为与细胞凋亡关系密切[4],张光谋等[5]报道 Bcl-2和 Bax基因参与了心肌肥大心肌细胞凋亡的调控。Bc1-2它可抑制多种因素如氧自由基和 p53诱导的细胞凋亡[6]。Bax为促凋亡因子,其过度表达将加速由白细胞介素-3介导的细胞凋亡。当触发因素存在时,Bcl-2/Bax的比值决定着细胞是存活或是死亡。心肌细胞凋亡是心衰从代偿走向失代偿的转折点[7]。

实验研究表明 AngⅡ可诱导心肌细胞凋亡[8],在AngⅡ引起细胞凋亡的过程中有较多的信号通路参与。已经证实 AngⅡ的主要心血管生物效应由 AT1受体介导,通过细胞内的信号传导途径刺激 Bax的表达,抑制 Bcl-2表达,细胞内蛋白磷酸化增加,最终激活细胞内核酸内切酶和 Caspase蛋白酶,使细胞发生凋亡。因此,AT1R拮抗剂不仅具有血液动力学效应,还可能通过抑制 AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡而产生心肌保护作用[9]。

氯沙坦为新型血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ拮抗剂,在本试验中氯沙坦干预组通过阻滞 AngⅡ的促凋亡作用,显著抑制了心肌细胞凋亡。本实验结果提示:氯沙坦干预组比心衰组的心肌细胞凋亡指数明显降低,同时对抑凋亡基因和促凋亡基因具有双向调节的作用,能上调抑凋亡基因 Bcl-2蛋白的表达,下调促凋亡基因 Bax蛋白的表达,从而抑制或阻断心肌细胞凋亡的发生。说明氯沙坦抑制心肌细胞凋亡能逆转心肌受损,改善心衰进程,这可能是氯沙坦防治心力衰竭的分子作用机制之一。

综上所述,氯沙坦能通过拮抗神经内分泌、抑制血管紧张素Ⅱ的产生,调节凋亡基因 Bc1-2、Bax的表达,为氯沙坦治疗心力衰竭的机制提供了最直接的证据。在凋亡的早期[10],阻断线粒体途径介导的心肌细胞凋亡,可以抑制或逆转心肌重构、改善心功能、延缓或逆转心力衰竭的发生发展。

[1] 王志坚,杭 娟.氯沙坦对心力衰竭患者血浆内皮素-1和降钙素基因相关肽的影响 [J].中华现代内科学杂志,2006,3(5):501-503.

[2] 杨建业,张迎春.阿霉素诱导大鼠心衰模型的建立.郧阳医学院学报,2005,24(5):269-271.

[3] 陈源源,孙宁玲.缬沙坦对自发性高血压大鼠心肌凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表达的影响 [J].高血压杂志,2004,12(2):151-155.

[4] Chen C,Cui J,Lu H,et al.Modeling of the role ofa Baxactivation switch in the mitochondrial apoptosis decision[J].Biophys,2007,92(12):4304-4315.

[5] 张光谋,许重洁,王兴平,等.心肌肥大大鼠心肌细胞凋亡与 Bcl-2、Bax蛋白表达的变化 [J].陕西医学杂志,2009,38(4):396-411.

[6] Zhou J,Luo RB,Tang CF,et al.Efect of Bcl-2 protein family and p53 gene on regulating and controlling cell apoptosis[J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu Linchuang Kangfu,2007,11(10):1950-1952.

[7] 胡大一,马长生.心脏病学实践-新进展与临床案例.北京:人民卫生出版社,2005:61-62.

[8] Schmidt-OttKM,KagiyamaS,Ianphillips M.The multiple actions of angiotensin II in atherosclerosis[J].Peptides,2000,93(1):65-77.

[9] 榆 华,迟路湘.血管紧张素Ⅱ /l型受体拮抗剂对心肌细胞凋亡影响及机制[J].中国分子心脏病学杂志,2008,8(2):83-86.

[10] Khoynezhad A.Promising aspects and caveats of studies on anti-apoptotic therapies in patients with heart failure[J].Eur J Heart Fail,2007,9(2):120-123.