豚鼠膀胱 Cajal样细胞缺失模型的建立△

石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科(石河子 832000)

王江平 丁国富 王勤章▲ 李令勋 倪 钊 李应龙 王新敏 谢顺明 钱 彪 王文晓

近年来研究提示膀胱中 Cajal样细胞和逼尿肌的兴奋性和收缩活动密切相关,在膀胱动力紊乱性疾病中的作用也逐渐引起人们的关注。建立一种膀胱 Cajal样细胞缺失的模型,能更好地探讨 Cajal样细胞在正常膀胱及膀胱动力紊乱性疾病中的作用,并将为下一步研究治疗方法打下基础。持续的 c-kit信号刺激对于胃肠道 Cajal细胞的发生、发育及表型维持至关重要,通过体内阻断 c-kit信号途径可以建立胃肠道 ICC细胞缺失动物模型,膀胱中 Cajal样细胞表面也像胃肠道Cajal细胞一样表达特异性标记物-c-kit受体。所以,本实验拟参照胃肠道实验方法通过体内阻断 c-kit信号途径来建立豚鼠 Cajal样细胞缺失模型。

材料与方法

1 动物模型的建立 动物模型建立与分组:选取新生豚鼠 20只,随机分成实验组、对照组。实验组将出生 24h内的豚鼠腹腔内隔天注射 c-kit抗体(ACK2)100 μ g,共 5次,对照组腹腔内注射生理盐水,于第 10天手术取膀胱进行实验。

2 冰冻切片的制作 手术取出膀胱,切取膀胱全层组织,OCT包埋,-80℃预冷 30 min,用恒冷冰冻切片机切 20 μ m厚度切片,粘于多聚赖氨酸处理的载玻片上,凉干后,丙酮固定 10min。

3 免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察 每只豚鼠取一张切片,冰冻切片加 1%胎牛血清室温孵育 30min,再加入一抗 (小鼠抗大鼠 CD117,1∶100,500 μ g/ml,Millipore公司 )室温下湿盒内孵育 1h,取出切片置于 4℃孵育过夜后再加入二抗(FITC标记山羊抗大鼠 1∶25),置于 37℃湿盒内避光孵育 60min。以上各步间均以 0.01mol/L PBS漂洗 5min× 2次。拭净后甘油封片,每张切片在 LSCM(ZEISS LSM 510 MET A)下随机取 5个视野,测定 Cajal样细胞胞体和和突起所占面积的百分比,取其平均值进行统计。

观察 c-kit阳性细胞 LSCM技术参数:针孔1000 μ m,X轴点扫描点数 250,Y轴扫描点数 250,扫描步径 1 μ m,镜扫描速度 1mm/s,2次平均,物镜 40倍,长通 505激光透过,检测器波长 488nm,灵敏度19.8%。

结 果

两组可见双极 Cajal样细胞形态基本一致,呈梭形双极细胞,表现为以胞体为中心的向相反方向延伸的两个长突起和许多小突起,胞膜着色而胞浆和胞核不被染色,主要分布于逼尿肌肌束边缘和逼尿肌肌束中。对照组:①Cajal样细胞数量多(见图 1);②许多相邻两个 Cajal样细胞紧密连结,形成 Cajal样细胞二聚体。实验组:①Cajal样细胞数量明显减少(见图 2),3例未发现 Cajal样细胞;②视野下未见 Cajal样细胞二聚体(见附表 )。

附表 腹腔注射 ACK210d后两组豚鼠 c-kit阳性细胞率检测结果

附表 腹腔注射 ACK210d后两组豚鼠 c-kit阳性细胞率检测结果

注:*与对照组比较,P＜0.01

项 目 对照组 实验组c-kit阳性细胞 率 2.37± 0.42 0.47± 0.17*c-kit阳性细胞二聚体 0.62± 0.11 0.00±0.00*

图1 对照组 Cajal样细胞分布

图2 实验组 Cajal样细胞分布

讨 论

目前研究表明膀胱中 Cajal样细胞在膀胱中可能扮演起搏细胞和传导、调节神经肌肉信号的功能,在膀胱动力紊乱性疾病中的作用也逐渐引起人们的关注。在巨膀胱-小结肠-肠蠕动迟缓综合征患者的膀胱中Cajal样细胞明显减少,豚鼠糖尿病膀胱模型中 Cajal样细胞明显减少,提示膀胱 Cajal样细胞的缺乏,可能影响了膀胱中平滑肌细胞间的信息传递、神经传递及自发性电活动的产生。所以,有必要建立一种膀胱Cajal样细胞缺失动物模型来进一步探讨膀胱 Cajal样细胞的生理功能以及在膀胱动力紊乱性疾病中可能的作用,并将为下一步研究治疗方法打下基础。

在胃肠管 Cajal细胞能特异性表达 c-kit受体,并且 c-kit信号途径对于 Cajal细胞的发生、发育具有重要作用,持续的 c-kit信号刺激是小鼠胃肠管 Cajal细胞形成和维持所必须的[1]。 ACK2为 c-kit的单克隆中和抗体,其具有特异地拮抗 c-kit的作用。 Torihashi等[2]给新出生的小鼠腹腔注射 ACK2,发现阻滞 c-kit信号后,Cajal细胞失去正常表型而呈现出部分类似平滑肌细胞样表型,并导致小鼠肠管正常位相收缩紊乱、慢波活动消失。膀胱中 Cajal样细胞表面也像胃肠管Cajal细胞一样表达特异性标记物---c-kit受体,本实验参照 Torihashi等[2]的方法,通过腹腔内注射 ACK2来阻滞 c-kit信号,以期像胃肠管实验那样建立豚鼠膀胱 Cajal样细胞缺失模型。免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察发现正常豚鼠 10d幼鼠膀胱中可见 Cajal样细胞并呈网络状分布,许多相邻两个 Cajal样细胞紧密连结,形成 Cajal样细胞二聚体。在经 ACK2处理的实验组中发现 Cajal样细胞数量明显减少甚至消失,视野中未见 Cajal样细胞二聚体。以上证明像胃肠管一样,在豚鼠逼尿肌中 Cajal样细胞表达的 c-kit受体所介导的信号通路对于 Cajal样细胞的发生、发育具有重要作用,持续的 c-kit信号刺激是豚鼠逼尿肌 Cajal样细胞形成和表型维持所必须的,通过阻断 c-kit通路影响 Cajal样细胞的发生、发育以及表型的维持可以成功建立豚鼠逼尿肌 Cajal样细胞缺失模型。

[1] Ward SM,Sanders KM.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedside I.Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(3):602-611.

[2] Torihashi S,Nishi K,Tokutomi Y,et al.Blockade of kit signaling induces transdifferentiation of interstitial cells of cajal to a smooth muscle phenotype.Gastroenterology,1999,117(1):140-148.