替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的机制

郑振伟

血管紧张素受体阻断剂 （angiotensin receptor blockers，ARBs）目前已广泛用于高血压病的治疗。近年来相关研究显示替米沙坦等ARBs除具有拮抗肾素-血管紧张素系统的作用外，还可以通过上调脂联素表达来调节糖脂代谢[1-6]。而糖脂代谢和动脉粥样硬化密切相关[7]。目前研究发现替米沙坦上调脂联素的表达可能与激活过氧化物酶体增殖物活化受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）有关[8，9]，但是具体的机制尚不清楚。 基于此，笔者通过观察替米沙坦和 PPARγ阻断剂GW9662对体外培养3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响，探讨PPARγ在替米沙坦上调脂联素表达中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胎牛血清购自杭州四季青公司，DMEM培养基购自GIBCO公司，胰蛋白酶购自上海华美生物工程公司，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素均购自Sigma公司，替米沙坦购自上海勃林格殷格翰药业有限公司，GW9662购自Merck公司，脂联素抗体和β-actin抗体均购自Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养、诱导分化和鉴定 3T3-L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养扩增，按照如下方法进行诱导分化：将3T3-L1前脂肪细胞接种至24孔培养板上，待细胞融合后，加入含0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/ml胰岛素的DMEM培养液培养48 h，再以含10 μg/ml胰岛素的DMEM培养液培养48 h，随后以DMEM培养液继续培养6 d。

油红O染色法鉴定脂肪细胞：10%多聚甲醛固定细胞10 min，洗涤后，加油红O染液，染色10 min，异丙醇洗涤细胞2次。水洗5～10 min，倒置显微镜下观察染色情况。

1.2.2 替米沙坦和GW9662干预3T3-L1脂肪细胞

实验采用替米沙坦及PPARγ拮抗剂GW9662干预3T3-L1脂肪细胞。具体如下，诱导分化后的3T3-L1脂肪细胞洗去培养液，无血清条件下培养16 h后分入下列实验组：①替米沙坦组 （10 μmol/L)；②替米沙坦组（10 μmol/L）＋GW9662组（30 μmol/L)；③GW9662组（10 μmol/L）；④空白对照组。 各实验组干预24 h后获取3T3-L1脂肪细胞。

1.2.3 3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达测定采用实时定量RT-PCR法检测脂联素mRNA表达水平。取部分干预后的3T3-L1脂肪细胞，各组细胞分别提取总RNA，RT-PCR法逆转录至cDNA，脂联素引物参照Gengbank提供的序列，用Primer5.0合成，由上海生物工程公司合成。引物设计如下：5’-TGTTGGAATGACAGGAGCTGAA-3’（forward）；5’-CACACTGAAGCCTGAGCGATAC-3’（reverse）。应用SYBR GreenⅠ荧光燃料技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值。

1.2.4 3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达测定 采用Western-blot法测定3T3-L1脂肪细胞内脂联素蛋白水平。取部分干预后的3T3-L1脂肪细胞，提取总蛋白质，以牛血清白蛋白作标准曲线，BCA法测定蛋白浓度。常规电泳，转膜，封闭后分别加入如下抗体：脂联素抗体和β-actin抗体，4℃轻摇过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光试剂增强反应，X线压片曝光，用GSD8000密度扫描分析系统（英国UVP公司）进行图像分析，以脂联素与β-actin条带的吸光面积积分比值来评定脂联素的表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。数据均先求出均数±标准差（±s），各组数据首先进行正态性和方差齐性检验，多样本均数比较及两两比较采用ANOVA方差分析，检验水准 α＝0.05。

2 结 果

2.1 3T3-L1脂肪细胞诱导分化鉴定 诱导分化10 d左右的3T3-L1细胞90%呈脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴。油红“O”染色后可见诱导后的3T3-L1细胞中红染的脂肪滴。

2.2 3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达测定 实时定量PCR检测结果显示：与空白对照组相比，经GW9662干预后3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达水平明显降低 （P=0.035）；替米沙坦组脂联素mRNA表达水平明显增加 （P=0.049）；替米沙坦＋GW9662组（替米沙坦＋GW组）脂联素mRNA表达水平有增高趋势，但与空白组相比无统计学差异（P=0.376，图1）。

2.3 3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达测定Western blot检测结果显示：与对照组相比，GW9662干预后3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达水平有降低趋势，但无统计学差异（P=0.295）；替米沙坦组3T3-L1脂肪细胞中脂联素蛋白表达水平明显增加（P=0.017）；替米沙坦＋GW9662组脂联素蛋白表达水平有增高趋势，但无统计学差异 （P=0.376），见图2。

图1 3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达实时定量PCR测定

图2 3T3-L1脂肪细胞脂联素蛋白表达western测定

3 讨 论

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白激素，在糖脂代谢过程中起着重要的作用，对胰岛素抵抗、代谢综合征等有着重要的调节作用，其表达受PPARγ活性等多种因素影响[10]。

研究显示替米沙坦等ARBs在降压的同时可以上调脂联素的表达水平，还发现替米沙坦等ARBs具有独立于血管紧张素-醛固酮系统阻断的的PPARγ激活作用[9]，因此提示替米沙坦等ARBs上调脂联素表达可能与激活PPARγ作用有关，但具体机制尚不清楚，基于此笔者进一步探讨了PPARγ在ARBs上调脂联素表达中的作用。

本文结果显示，采用GW9662特异性阻断PPARγ后，3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达水平下降，进一步提示PPARγ活性在脂联素基因转录水平具有一定程度的调节作用。此外，本文结果还显示替米沙坦可以明显增加脂联素mRNA和蛋白表达水平，而GW9662可以在一定程度上抑制替米沙坦上调脂联素表达的作用。由此可见，PPARγ活性在替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达过程中可能起着一定程度的作用。然而，由于脂肪细胞表达脂联素还受其它因素影响，除PPARγ激活通道外替米沙坦等ARBs上调脂肪细胞表达脂联素是否还存在其它机制，还需进一步研究探讨。

[1]Delles C,Raff U,Mimran A,et al.Effects of telmisartan and ramipril on adiponectin and blood pressure in patients with type 2 diabetes.Am J Hypertens,2008,21(12):1330-6.

[2]Ichikawa Y.Comparative effects of telmisartan and valsartan on insulin resistance in hypertensive patients with metabolic syndrome.Intern Med,2007,46(17):1331-6.

[3]Makita S,Abiko A,Naganuma Y,et al.Effects of telmisartan on adiponectin levels and body weight in hypertensive patients with glucose intolerance.Metabolism,2008,57(10):1473-8.

[4]Sasaki T,Noda Y,Yasuoka Y,et al.Comparison of the effects of telmisartan and olmesartan on home blood pressure,glucose,and lipid profiles in patients with hypertension,chronic heart failure,and metabolic syndrome.Hypertens Res,2008,31(5):921-9.

[5]Bahadir O,Uzunlulu M,Oguz A,et al.Effects of telmisartan and losartan on insulin resistance in hypertensive patients with metabolic syndrome.Hypertens Res,2007.30(1):49-53.

[6]彭晓玲，林泽鹏，张志伟.替米沙坦对伴有高血压的不稳定性心绞痛患者血清脂联素、C反应蛋白及心功能的影响.南方医科大学学报，2007，27(11)：1767－1770.

[7]李兆全，林 涛，王艳红，等.心绞痛患者血清脂联素与肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的相关性.中华高血压杂志，2007，2:161-162.

[8]季东林，李晓琼，郭锡熔，等.脂联素基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化中表达水平变化的研究.南京医科大学学报（自然科学版)，2006，4:234-237.

[9]Ernsberger P,Koletsky RJ.Metabolic actions of angiotensin receptor antagonists:PPAR-gamma agonist actions or a class effect?Curr Opin Pharmacol,2007,7(2):140-5.

[10]Yamada S,Ano N,Toda K,et al.Telmisartan but not candesartan affects adiponectin expression in vivo and in vitro.Hypertens Res,2008,31(4):601-6.