大肠杆菌耐药机制的研究进展

（河南农业大学牧医工程学院, 河南郑州 450002）

致病性大肠杆菌是人类和动物临床上最常见的病原之一，是威胁人类和动物健康的重要致病菌，也是近年来食品卫生、给水卫生及流行病学领域最重要的研究对象之一。在兽医上，它一年四季均可发病，鸡、鹅的发病率约为l0%～69%，大肠杆菌有致病性的占10%～15%，死亡率为3.8%～72%，从河北、北京、天津地区发生仔猪黄、白痢的10个猪场分离60株大肠杆菌，其中致病性大肠杆菌55株，耐药率较高的分别为链霉素(80%)、庆大霉素(53.3%)、氨苄青霉素(75%)、复方新诺明(86.7%)、痢茵净(76.7%)，每一种新药推广应用，总是伴随着耐药菌株的出现，这给细菌性疾病的防治工作提出了更高的要求和难度。抗生素的广泛持续和不当使用，导致大肠杆菌耐药株的不断增多，耐药机制的不断变迁，特别是大肠杆菌多重交叉耐药株的大量出现，使人医临床和兽医临床对大肠杆菌病的治疗变得十分困难，有时甚至找不到可治之药。大肠杆菌的耐药性问题已经引起了国内外医药界的广泛重视。

一、病原菌对抗生素的耐药现状

自1929年弗来明发现青霉素以来，伴随着抗生素和化学抗菌剂的开发使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药也日趋严重。有文献报道，20世纪90年代后期，兽医临床上抗菌素被广泛、长期使用，20世纪90年代以前、20世纪90年代、20世纪90年代以后(鸡、猪)耐药菌株百分比分别为28.73%、43.19%、53.47%，说明大肠杆菌耐药性逐渐增强。目前病原细菌对青霉素的耐药率达88%以上，对庆大霉素耐药率超过75%、对大多数喹诺酮类药的耐药率也达50%以上，对头孢一代、二代的耐药率为40%～65%。

二、细菌的耐药性机制

据耐药状况，1994年远东地区感染性疾病会议将细菌耐药分为两类：第一类，单类耐药性，即因单耐药因素，细菌对一类抗菌药物的所有种类都耐药。第二类，多重耐药性，因质粒和染色体介导的耐药因素，细菌对多类抗菌药物耐药。据细菌耐药性的起源，又可将其分为：⑴固有耐药性，即耐药性的产生并不依赖于抗菌药物的存在，而是细菌细胞所固有的，与细菌的遗传和进化密切相关。固有耐药性是细菌稳定的遗传特性，它受细菌染色体DNA控制并且是同属细菌的共同特征，固有耐药性包括自发基因突变导致的耐药性和细胞膜药物外输作用引起的耐药性，如肠道阴性杆菌对青霉素的耐药；绿脓杆菌对氨苄西林的耐药；链球菌对庆大霉素的耐药等；⑵获得性耐药性，是指细菌在抗菌药物选择性压力存在下经过基因突变，或细菌在生长过程中由于移动耐药因子的转移而获得的一种表型。其中移动因子包括质粒、转座子、整合子和噬菌体。获得性耐药性主要包括移动因子和抗菌药压力作用下引起基因突变所导致的耐药性。抗生素耐药可以通过各种机制产生，包括结合靶物的失败，对药物靶物的过度表达，药物的修饰和衰减，渗透屏障的产生或药物外输的激活。包括以下几个方面。

（一）改变靶位蛋白抗生素作用位点的改变或药物作用表位的过度表达。抗生素作用位点的改变可能是大肠杆菌对某一类具有相同或相似结构抗生素耐药的最主要因素，例如氟喹诺酮类药物作用位点一编码旋转酶的gyrA、gyrB基因、编码拓扑异构酶Ⅳ的parC、parE基因的点突变是大肠杆菌对喹诺酮类耐药的最主要原因。

（二）产生灭活酶酶对抗生素的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一。包括β-内酰胺酶、氨基糖苷修饰酶、乙酰转移酶(耐氯霉素)和酯酶(耐大环内酯类)。

（三）改变外膜通透性减少抗菌药物进入菌体,减少抗生素向大肠杆菌内的摄人而引起的大肠杆菌的耐药。近年来的研究表明，大肠杆菌的外膜在耐药过程中起着重要的作用。大肠杆菌的外膜对许多抗菌药物的通透性较低，形成一道天然的屏障，阻碍抗菌药物进人菌体细胞内发挥抗菌作用。然而大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质，却对大多数疏水性药物具有良好的通透性。大肠杆菌外膜的孔蛋白主要OmpA、OmpF、OmpC， 据 报 导OmpF数量减少可以使细胞膜对抗生素的通透性下降，造成细菌对多种抗生素的敏感性下降，OmpF在保持细菌外膜正常通透性中起着重要作用。显然这些膜孔蛋白的表达水平的变化可对细菌的耐药性产生响。例如，许多抗菌药物如β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、氨基糖苷类、亲水的氟喹诺酮类药物均主要通过大肠杆菌外膜孔蛋(OmpF和OmpC，主要是OmpF)进入细胞内发挥抗菌作用。然而，膜通透性的改变只能引起大肠杆菌低程度的耐药，多重耐药主要与主动外排系统有关。

（四）药物外输作用引起的耐药性药物外输作用是微生物对药物产生耐药性的一个很重要机制，它是由药物外输泵(主动外输系统)来完成的。药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，药物外输泵系统相关mRNA的表达增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加，使细胞内的药物被泵出。外输作用机制引起的耐药性首先是2O世纪7O年代初在对四环素的耐药性研究中报道的，其后包括喹喏酮类药物在内的一系列抗菌药针对多种细菌的耐药性研究陆续报道，一些外输作用决定子也被克隆并进行了序列测定。现已发现多种药物外输系统，目前为止根据氨基酸序列的同源性将其分为五个超家族：MF (major facilitator)家族，SMR(small multi—drug resistance) 家族，RND(resistance nodulation cell division)家 族，ABC (ATP binding cassette)家族和MATE(multi—drug and toxic compound extrusion)超家族。革兰氏阳性和阴性细菌的细胞膜外蛋白l7种全序列和2种部分序列组成同源膜融合蛋白家族(MFP)。每一种蛋白功能均和ATP结合盒家族、主易化家族、重金属耐药／小结节／细胞分裂家族的促进转运蛋白、肽、药物和碳水化合物通过革兰氏阴性菌的细胞双层膜的细胞膜转运有关。MF家族的膜转运有l2～l4种膜转运蛋白如：Bcr(大肠埃希氏菌)，EmrB(大肠埃希氏菌)、EmrD (大肠埃希氏 菌 )、MdfA ／ Cmr(大 肠 埃 希氏菌)、NorA (沙门氏菌)、QacA(金黄色葡萄球菌)和Bmr(枯草芽孢杆菌)和它们这些不同特点的药物输出系统媒介。SMR家族更准确的说有四种膜转运区SMR (或QacC)(沙门氏菌)、QacE(产气克雷伯氏菌)和EmrE(大肠埃希氏菌)。EmrE似乎和大环内酯类组成一个有机体，更象是一个三聚物。这个家族的一些蛋白功能是作为一个低寡聚物。RND家族通常作为比进入周质更直接的主动排出物质的三组外输系统组合。此外，内膜RND转运基因包含膜融合蛋白(MFP)和一种外输膜因子(OMF)。大肠杆菌AcrA—AcrB-TolC、EmrA T0lc两系统和MexA—MexB-OprM(沙门氏菌)是三重外输系统，AcrB和MexB是RND转运基因，AcrA和MexA是MFPs，TolC和OprM 是OMFs。一种电化学H+跨膜梯度是MF，SMR和RND家族药物转运排出的动力。ABC家族利用ATP作为能量来源。LmrA (乳酸乳球菌)和MsrA (沙门氏菌)是MATE家族的转运因子，有l2预计的片段和MF家族相似。然而MATE家族转运因子和MF家族的任何膜并不表现特殊的序列相似性．NorM (弧菌属)是这个家族的成员。NorM 似乎和Na 主动外排有关。外输系统的作用底物总的可以包括抗菌药、染料、消毒剂、洗涤剂、有机溶剂、亲脂阳离子、脂类、抗微生物多肽类、化学药物等。外输系统可能是在细菌进化过程中形成的一种细胞自身解毒系统。在细菌基因组中，一般都存在外输系统的调节基因。增强外流使进入菌体内的抗菌药物迅速外流，药物从大肠杆菌主动外排的增加引起大肠杆菌的多重耐药。大肠杆菌的耐药性可以是固有的，也可以通过基因突变、基因转移的过程而获得大肠杆菌的获得性耐药可包括以上四类，对一种抗生素常具有一种以上的耐药机理。

（五） 细菌生物被膜的形成细菌生物被膜是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。细菌间的多糖蛋白复合物形成孔道维持细菌物质代谢。常见的形成细菌生物被膜的临床致病菌有铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌等。细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生耐药性，其原因有：⑴细菌生物被膜可减少抗菌药物渗透。⑵吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解。⑶细菌生物被膜下细菌代谢低下，对抗菌药物不敏感。⑷生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用．针对外排泵介导耐药性治疗措施随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性越来越严重，而且有明显上升趋势，给临床治疗造成极大困难。抗菌药物发现和应用的早期，几乎所有的细菌感染性疾病，只要使用一种抗菌药物就能够容易的治愈这些病。但是，这种乐观的局面由于耐药菌的出现而很快被改变。大多数耐药菌开始时对抗感染药物是敏感的，但长期使用抗菌药物的环境使得耐药菌得以选择性的发展，或通过染色体的改变，或通过耐药质粒、转座子的转移所获得的多种耐药机制，严重影响了临床抗感染治疗的效果。

三、大肠杆菌耐药抑制剂

大肠杆菌已形成对多种抗菌药物耐药的多种耐药，解决大肠杆菌的耐药性问题已经刻不容缓。有如下4种方法有望解决大肠杆菌的耐药性问题。

（一） 减少抗菌药物的使用并保护现有的药物通过对医务工作者和公众的教育，通过他们间的合作，对于能用简单的控制方法解决的就不用抗菌药物进行治疗(如适当的洗手，兽医临床上注意饲料、饮水及饲养环境的卫生等)。

（二） 开发新的抗菌药物膜通透性较好的抗菌药物，使得药物内流速度大于药物被外排的速度，保证菌株对该抗生素敏感性。但开发一个新的抗菌药物需要l0年，花费几亿英镑，但随着耐药机制的不断变迁，新药的应用周期被无形中缩短。现在有几种药物正在开发中噁唑烷酮类和晚霉素类是两种完全新型的药物。另外还有奎奴普丁／达福普汀，甘氨酰环素类以及新的氟喹诺酮类、糖肽类和碳青霉素类药物等。

（三） 研制大肠杆菌多重耐药抑制剂大肠杆菌的AcrAB泵可介导多种药物的外输，如果使该系统失活，大肠杆菌即从多重耐药状态变为相对敏感状态，因而研制出的有效抑制剂能在相当程度上克服其耐药性。

第一类，大肠杆菌E．coli的RND-type转运子的抑制剂——MG2O7，l10 (苯 丙 氨 酸-精 氨酸-β-萘胺)，是一种竞争性外排蛋白抑制剂，具二肽酰胺结构的小分子化合物，可显著抑制临床常见的具多重耐药外排泵的铜绿假单胞菌、金色葡萄球菌、肠球菌、革兰阴性菌等耐药菌。该化合物本身无抑菌作用，其MIC>256μg /ml，但与氟喹诺酮、大环内酯、β-内酰胺类抗生素联合运用可显著提高耐药菌的敏感性．与抗真菌药氟康唑、依康唑及特奈芬等联合运用也可增加对因外排泵机制耐药的白念珠菌的作用。

第二类，l-(1-Naphthylmethy1)-piperazine是MDR家族逆转机制的外输泵抑制剂：砷酸盐；Phe-Argβ-naphthylamide(PAIβN)或 其 它N-杂环有机复合物如：1-(4-萘基丁基)-哌嗪(PBP)；l-(1-萘基)哌嗪(PP)，l-(1-萘甲叉)-哌嗪(NMP)，和1-[4-(2-萘基)丁基]-哌嗪；l-(3-三氟甲噻嗪)-哌嗪(mTFMPP)等大多都是未取代的芳基哌嗪。

（四）开发不使用抗菌药物治疗感染的治疗策略针对主动外排系统能量来源制剂如DNP (2，4二硝基酚)或间一氯苯羰氰化物(CCCP)，检查药物摄取率增加与否测得。该过程通过去偶联作用使膜两侧的能量梯度消失或能量被抑制，药物不可能被泵出，表现为药物摄取率增加。事实上，仅在毫摩尔浓度下有效能量抑制剂CCCP能增加细胞对氟喹诺酮类药物的摄取量。通过信号标记诱导的大量突变及障碍码分辨系统开发的对这些高度特异靶位的药物比传统的抗菌药物具有更窄的作用谱；构建的工程DNA质粒可以破坏病原菌灭活抗菌药物的基因和破坏负责毒力的基因的研究工作正在进行中。

总之，大肠杆菌和其他病原菌一样对抗菌药物的耐药性是一个复杂的、持续进化的问题，耐药性问题的解决是一项非常艰巨的任务。