猪人工授精实验室操作规程

李 强

（四川省畜禽繁育改良总站，四川 成都 610041）

1 猪人工授精实验室的环境要求

实验室要求整洁、卫生，每周要彻底清洁一次。

实验室要求与采精室相邻，实验室应分成干燥区和潮湿区，干燥区用于稀释液的配制和精液的检查、稀释、分装，潮湿区安放水槽，用于清洗器械等。实验室内最好安装紫外线灯，每周至少对实验室彻底消毒一次，下班时开启，通宵照射。

2 猪人工授精实验室设备要求

2.1 显微镜 其放大倍数可为100、400和 1000倍（油镜），最好自带光源、配备恒温加热板。

2.2 精子密度测定仪或血细胞计数器 能比较准确地分析出原精密度，确定稀释倍数。

2.3 电子台称 用于称量精液质量。

2.4 电子天平 称量药品配溶液用（精度达到0.01g）。

2.5 数显恒温水浴锅 加热精液稀释液以及用于控制精液稀释液的温度。

2.6 17℃数显恒温精液保存箱波动范围在±1℃，用于精液的存放。

2.7 数显恒温干燥箱和高温灭菌锅 用于实验器皿的预热和消毒。

2.8 双重蒸馏水器 用于制备双蒸水，稀释液用水最好为3d内制的新鲜蒸馏水。

2.9 量筒、烧杯 1000 mL、2000 mL各两个，用于准备稀释液、稀释精液以及将精液分装到输精瓶。

2.10 保温瓶 各种不同的容器可用于采精，但重要的是要能保温隔热、能被消毒。

2.11 pH试纸或pH计 测量精液的pH值。

2.12 玻璃棒 稀释精液搅拌用。

2.13 温度计2支 分别用于测量精液和稀释液的温度。

2.14 其他 稀释液配置和精液检查必备的试剂及药品、100～500 μL微量移液器及其配套吸头、采精杯、消毒外科用纱布、输精瓶（装 100 mL）、浴巾（保温用）、市售成品稀释粉或一些配制精液稀释液所用的药品。

3 实验室的准备工作

3.1 器械的清洗和消毒 （最好采精前一天进行）

3.1.1 洗涤 将采精杯，烧杯，量筒等玻璃器皿用洗衣粉或洗洁精清洗干净，再用蒸馏水冲洗2次。

3.1.2 消毒 用锡纸包扎玻璃器皿的开口和金属器械，放恒温干燥箱中180℃干燥1h，也可和非耐热器皿一起，用牛皮纸包好放高压灭菌器中121℃，20 min湿热灭菌；温度计采用酒精棉球消毒；消毒过的器械使用前用稀释液冲洗一遍。

3.2 采精前准备工作

3.2.1 采精前2h，工作人员穿上实验服，擦净所有工作台，保持室内清洁。

3.2.2 用消毒外科纱布套好集精杯，将集精杯、载玻片、盖玻片及稀释用的玻棒、温度计、烧杯等放入37℃恒温干燥箱中预热。

3.2.3 采精前1h，配制好稀释液。

如用市场上出售的成品精液稀释粉，则应在采精前的1h将稀释精液和双蒸馏水按说明比例混匀。

3.2.4 打开水浴锅，将温度调至37℃，将配置好的稀释液放入其中预热。

3.2.5 准备好显微镜，并将恒温载物台设定到37℃，将载玻片放在上面预热。

3.2.6 准备好电子台秤、精液密度仪或血细胞计数器、微量移液器及其配套吸头、签字笔、记号笔、记录本、盖玻片等，称量盛放精液的烧杯的质量并记录。

3.2.7 将预热好的采精杯放入保温瓶中，到采精室采精。

4 精液的品质检查

4.1 将采集的精液 （用采精杯采集） 从保温瓶中取出，将用橡皮筋套住的过滤用纱布拿开，而后将精液轻轻地导人预热好的烧杯中。

4.2 精液量（体积）测定 以电子台秤称量精液，按每克1 mL计，精液量（g）=（精子的质量+盛放精液的烧杯的质量）一盛放精液的杯子的质量。避免以量筒等转移精液盛放容器的方法测量精液的体积。

4.3 颜色 正常的精液是乳白色，呈云雾状。精子密度越高。颜色越白，其透明度愈低。如呈灰白色或浅灰色，则表示精液密度低，且质量不好。如带有绿色或黄色是混有脓液或尿液，若带有淡红色或红褐色是含有血液，表明精液中有炎症物，这样的精液应舍弃不用。

4.4 气味 一般正常精液无味或略带有腥味。如果精液带有恶臭味，应废弃不用。

4.5 pH值 （酸碱度） 以pH计或pH试纸测量。正常精液的pH值为6.8～7.8，呈中性或弱碱性。

4.6 精子活力检查 检查时，用微量移液器取精液一滴于显微镜载物台恒温加热板上已预热好的载玻片上，盖上盖玻片,由下至上调节显微镜物镜，直至出现看到清晰精液。然后计算直线运动的精子占总精子的比例。

4.7 精子密度检查 指每毫升所含的精子数的多少，是确定精液稀释倍数、评定精液品质的重要指标。要求用血细胞计数板或精液密度仪进行测定。血细胞计数板计数方法：以微量加样器取具有代表性原精液100 μL，3%NaCl900 μL，混匀，稀释 10 倍；血细胞记数室上放一盖玻片，取1滴上述精液放入计数板槽中，靠虹吸将精液吸入计数室内；在高倍镜下计数5个中方格内的精子总数，将该数乘以50万，即得原精液每毫升的精子数（即精液密度）。精液密度仪使用参照其使用说明书。

精子密度也可采用估测法在显微镜下观察，将精子分布情况分为密、中、稀三种。密：精子密集，精子间距离小于一个精子距离（每1mL 3亿以上）；中：精子间能容纳1～2个精子；稀：精子间距离很大，精子间能容纳2个以上精子（每1mL约1亿）。

4.8 精子畸形率检查 畸形率即畸形精子占精子总数的百分率，一般要求畸形率不超过15%，要求每头公猪每两周检查一次畸形率。畸形精子种类很多，包括巨型精子、短小精子、双头或双尾精子、顶体膨胀或脱落、精子头部残缺或与尾部分离、尾部弯曲等。

4.9 认真填写精液品质检查登记表。

5 精液的稀释

5.1 精液采集后应尽快稀释，原精液放置不能超过30min。

5.2 稀释倍数的确定：活力≥0.7的精液，一般按每个输精剂量含40亿个有效精子，输精量为80mL确定稀释倍数。

5.3 品质检查不合格（活力0.7以下）的精液不能稀释。稀释时稀释液要求与精液等温，两者温度相差不能超过1℃，即稀释液应加热至33～37℃，以精液温度为标准，来调节稀释液的温度，不能反过来操作。

5.4 稀释时，将稀释液沿温度计，玻璃棒或盛精液的杯(瓶)壁缓慢加入到精液中，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，使其混合均匀。

5.5 高倍稀释时，应先进行低倍稀释（1∶1～2），稍待片刻后再将余下的稀释液沿壁缓慢加入。

5.6 稀释后要求静置片刻再作精子活力检查。如果稀释前后精子活力一样，即可进行分装与保存；如果活力下降，说明稀释液的配置或稀释操作有问题，不宜使用，应查明原因并重新配置。

6 精液的常温保存

6.1 精液稀释后检查精液活力，若无明显下降，立刻按每头份80mL分装入瓶，尽量减少精液暴露于环境中的污染时间。

6.2 加盖密封，在标签上写清楚公猪的品种、耳号、采精日期（月、日、时），精液量、稀释倍数、储存温度，良种补贴专用等。

6.3 放置22～25℃的室温下1h后或用多层毛巾被包好后放置17℃冰箱中，让其温度缓慢下降，以免因温度下降过快造成死精子数增多。

6.4 保存过程中要求每12h将精液混匀1次，每次摇动时，动作要轻缓均匀，同时观察精液的色泽状态，做好记录，发现异常及时处理。

6.5 每天检查精液保温箱的温度，若出现停电应全面检查贮存精液质量。

注意：要尽量减少精液保存箱关开次数，以免造成对精子的打击而导致精子死亡；

6.6 每次使用前应对保存的精液进行活力检查，活力低于0.6的精液应弃之不用。

6.7 稀释后精液一般要求在3d内用完，否则会影响使用效果。