鸡传染性喉气管炎的诊断

薛春宜，曹永长，王林果，毕英佐

（1.中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州 510006；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

鸡传染性喉气管炎的诊断

薛春宜1，曹永长1，王林果2，毕英佐2

（1.中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州 510006；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

传染性喉气管炎病毒(ILTV）是一种能够引起鸡急性上呼吸道感染的疱疹病毒。由它所引起的疾病称为鸡传染性喉气管炎。该病毒在分类上属于疱疹病毒科α亚科，学名为鸡疱疹病毒I型(gallid herpesvirus l ）。1925年，该病首先报道于美国，并命名为气管-喉头炎，后又称为传染性支气管炎，支气管肺炎等。1963年Gruiehk shank在电镜下观察负染标本，证明本病毒的形态结构同单纯疱疹病毒一致后，才明确了引起ILT的病毒属于疱疹病毒。2000年，国际病毒分类委员会(ICTV）将ILTV从水痘病毒属划出，建立一个新属：类传染性喉气管炎病毒属，这个属唯一的病毒就是ILTV。

ILTV只有一种血清型，在鸡上表现不同的毒力。与其它的疱疹病毒不同，ILTV的宿主范围窄，几乎只感染鸡和鸡源细胞。ILTV可以在鸡的呼吸道上皮细胞迅速复制并能在感觉神经元进行潜伏感染。感染ILTV的鸡呼吸困难、咳嗽、气喘，引起喉头气管黏膜肥厚、肿胀、糜烂和出血。鸡群感染此病毒后，发病率为90%～100%，死亡率为5%～70%(平均20%），可造成大的经济损失。近年来，该病己经在包括我国在内的世界范围内，特别是养鸡业集中的地区传播，已经成为养鸡业的重要疫病之一。

在自然条件下，本病主要侵害鸡，虽然各种年龄的鸡均可感染，但以成年鸡的症状最为特征。病鸡及康复后的带毒鸡是主要传染源，经上呼吸道及眼分泌物传染。易感鸡群与接种了疫苗的鸡作较长时间的接触，也可感染发病。被呼吸器官及鼻腔排出的分泌物，污染的垫草、饲料、饮水和用具可成为传播媒介。人及野生动物的活动也可机械传播。种蛋蛋内及蛋壳上的病毒不能传播，因为被感染的鸡胚在出壳前均已死亡。本病一年四季都能发生，但以冬春季节多见。鸡群拥挤，通风不良，饲养管理不善，维生素A缺乏，寄生虫感染等，均可促进本病的发生。此病在同群鸡传播速度快，群间传播速度较慢，常呈地方流行性。本病感染率高，但致死率较低。该病发病机制是由于病毒在喉头和气管黏膜的上皮细胞中繁殖，引起这些黏膜的发炎和一部分上皮细胞中的嗜酸性核内包涵体的形成。由病毒所致的黏膜发炎，常因兼性病原菌的侵入而恶化，在黏膜上形成纤维蛋白假膜，引起呼吸困难或窒息，病毒只侵入血液中，但并不在血液中繁殖，所以不引起病毒血症。

该病和多种疾病常常并发，造成该病诊断比较难。这里介绍诊断该病的几种方法。

一、初诊

临床上可根据临床症状和剖检病变对该病做出初步诊断。

（一）临床症状病鸡伸颈张口吸气，低头缩颈呼气，闭眼呈痛苦状。多数鸡表现精神不振，食欲下降或拒食，呼吸时发生湿性咳嗽，发出响亮的喘鸣声，呈下蹲姿势。咳嗽时甩头，甩出血样痰液。从鼻流出浆液性或脓性粘液，呈半透明状。有时眼角存在脓状物，眼睑肿胀，甚至封闭整个眼球。严重病例可见极度呼吸困难，痉挛性咳嗽，咳嗽或摇头时咯出带血的粘液，有的病鸡因气管内渗出物不能咳出而窒息死亡。病鸡稍瘦，鸡冠和肉髯发绀。有时排出绿色、黄白色稀便，最后多因衰竭而死亡。若是产蛋鸡，其产蛋量迅速下降或停止，产薄皮蛋、无壳蛋增多。

（二）剖检病变剖检病死鸡可见气管和喉头黏膜明显充血、出血和肥厚，气管上皮坏死，出血性气管炎和喉炎，气管腔内有大量渗出物及凝固似红绫子样的血性痰液，有假膜的很容易剥离；鼻黏膜充血、肥厚，腔内有大量粘液，喉头处有干酪样栓子；有的病鸡还伴有结膜炎变化，常见眼睑周围肿胀，结膜充血，水肿，有时有点状出血，下眼睑水肿，角膜出现溃疡等病理变化。少数病鸡在气管黏膜表面有一层假膜，全身器官组织严重瘀血。

鸡传染性喉气管炎的临诊症状和病理变化与某些呼吸道传染病，如鸡新城疫、传染性支气管炎有些相似，易发生误诊。现场可通过以下几点诊断：①本病常突然发生，传播快，成年鸡发生最多；发病率高，死亡因条件不同而差别大。②临诊症状较为典型，张口呼吸、喘气、有啰音，咳嗽时可咳出带血的粘液；有头向前向上吸气姿势。③剖检死鸡时可见气管呈卡他性和出血性炎症病变，以后者最为特征；气管内还可见到数量不等的血凝块；如有条件可结合病毒分离、鉴定和动物接种来进一步确诊。

二、实验室诊断

（一）病毒分离鉴定技术

1.病料采集和运输。病料的准备：①活体采样。用灭菌棉拭子伸入口咽或气管采集分泌物，放入含青霉素4 000 IU/ml和链霉素4 000 μ g/ml的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，处理方法同上。②尸体采样。无菌采取病死鸡喉头和气管，放入无菌的平皿或烧杯中，密封。

采集的样品应立即放入4℃冰箱保存，24 h内送到实验室；不能在24 h内送到实验室时，应将所采样品冷冻保存和运输。

2.样品处理。

（1）收到棉拭子样品后，先冻融2次，并充分振动、挤干棉拭子，将样品液经10 000 r/min离心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml、链霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作为接种材料。

（2）组织样品：无菌条件下将组织剪碎，按1：4加入生理盐水后用研磨器研磨制成20%的匀浆悬浮液，再经10 000 r/min离心10 min，取上清液，加入青霉素4 000 IU/ml，链霉素 4 000 μ g/ml，于 37℃作用30 min，作为接种材料。

3.接种鸡胚。取经处理过的样品，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜。每枚0.2 ml，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7 d，弃去24 h内死亡的鸡胚，24～120 h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120 h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。有痘斑者，取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨后，置-20℃冻存备用；无痘斑者，亦取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨，反复冻融，离心后，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜盲传。盲传3代以上，如仍无病变，则判为鸡传染性喉气管炎阴性。

4.病毒鉴定。用鸡传染性喉气管炎标准阳性血清（效价在1∶32以上）和标准阴性血清与分离物作鸡胚中和试验。

（1）血清处理。将传染性喉气管炎标准阳性血清和标准阴性血清56℃灭活处理30 min。

（2）病毒稀释。将病毒分离物用含青霉素1 000 IU/ml和链霉素1 000μ g/ml的灭菌生理盐水做10倍系列稀释。

（3）病毒-血清混合液。设两排试验管，每排4个管，第1排每管放0.6 ml标准阳性血清，第2排每管放0.6 ml阴性血清，然后向每排1～4号试验管内分别加入(2×10-2～2×10-5）稀释的病毒悬液各0.6 ml，将病毒-血清悬液混合并置冰箱(4℃～8℃）4 h。

（4）鸡胚接种及结果判定。取经处理过的病毒-血清混合液，分别接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2 ml/枚，每管接种5枚，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7 d，弃去24 h内死亡的鸡胚，24～120 h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120 h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。记录观察结果，按Reed-Muench方法计算EID50。

5.结果判定。如分离物能引起鸡胚绒毛尿囊膜出现典型的痘斑，并且经鸡胚中和试验，其阴性血清组和阳性血清组的EID50的对数之差大于或等于2.5时，则判定分离物为鸡传染性喉气管炎病毒。

（二）琼脂凝胶免疫扩散试验用含8%氯化钠的蒸馏水加万分之一叠氮钠配制成1%琼脂糖，103kPa高压蒸汽灭菌或水浴加热使琼脂充分溶化，加入直径为85 mm的培养皿中，每皿16 ml，平置，室温下凝固后，置4℃备用。在琼脂糖平皿上，按坐标纸上画好的梅花型打孔，孔径4 mm，孔间距3 mm。挑出孔内琼脂，在火焰上封底。用微量移液器加样，中央孔加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔加待检血清，每孔均以加满不溢出为度。加样完毕后，静置10 min，放入37℃带盖的湿盒中反应，分别在12 h、24 h、36 h观察并记录结果。被检样品孔与中央孔之间形成清晰的沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合者为阳性。被检血清孔与抗原之间无沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线直伸向被检血清孔的边沿无弯曲者，判为阴性。

（三）血清中和试验（SN）将ILTV特异性的血清和待检病料一起孵育后接种鸡胚或细胞进行血清中和试验，根据鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上或细胞的痘斑数量的有无或多少判定，检测自然感染或试验感染的血清抗体时，ILTV接种后一周即可测出中和抗体。

（四）包涵体检查用棉拭子采取发病后2～3 d鸡喉头黏膜上组织制成切片，姬姆萨染色、镜检。取发病后2～3 d的鸡喉头黏膜上制成切片后，姬姆萨染色，镜下发现细胞内有紫色、周围有晕轮状的包涵体即可判为阳性。

（五）动物回归试验以病毒分离物经气管内途径接种易感鸡，然后常规饲养，记录发病情况，3～7 d后扑杀检查。具体操作如下：取病鸡气管分泌物，按1∶5加生理盐水稀释，用棉签蘸取稀释液涂擦喉头和上腭，接种60日龄易感鸡10只，再用生理盐水接种同日龄鸡10只作对照。3～7 d后可见感染鸡出现ILT典型临床症状和病理变化，易感鸡出现呼吸困难，流泪，结膜发炎，眶下窦，鼻窦肿胀。剖检病鸡发现喉头和气管出血严重，而对照组均无异常变化。

（六）酶联免疫吸附试验（ELISA）该方法可以快速、敏感地做出诊断，一次可检测多个样品，可用于ILTV抗体的检测和定量，但对抗原的纯度要求很高。具体操作方法可参考试剂盒说明书进行。

（七）分子生物学诊断

1.PCR检测。聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。

采用病毒DNA抽提试剂盒，直接从疑似ILT感染病料，或者病料接种后获得的病毒产物中提取DNA。采用1对特异性引物d00565-1（5’-GGCAACGGATTC CGGCATTTAGTC-3’）/d00565-2（5’-GACGCCTCCCGACATTCAA GTTTT-3’），按下列反应程序进行PCR扩增：95℃3 min；94℃40 s，58℃ 40 s，72℃ 40 s，共进行 30个循环；然后72℃保温10 min。用1%浓度的琼脂凝胶电泳，120V30 min，见有335bp大小的带即可判定为阳性，否则为阴性。

2.分子杂交技术。该技术的运用使ILTV不同毒力的鉴别，以及与其他禽病毒的区分成为可能。不仅对鉴定ILTV提供安全有效的手段，而且能快速、简便地检出潜伏期感染的ILTV，但不能可靠地在原始病料中检出病毒。

3.环介导的等温扩增技术。环介导等温扩增 (LAMP） 是最近开发的一种新颖的恒温核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域, 设计4种特异引物，利用一种反转录酶（AMV反转录酶）和一种链置换DNA聚合酶(Bst dNA polymerase）在恒温(65℃左右）中保温1 h左右，即可完成核酸扩增反应，反应结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察，或者直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，也可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。本实验室针对传染性喉气管炎病毒的胸苷激酶基因（TK），设计一套引物，在65℃下反应1 h，可以检测到目标产物，其灵敏度比常规PCR技术高10倍。

三、鉴别诊断

临床上传染性喉气管炎与鸡新城疫、传染性支气管炎、禽霍乱等有部分相似，需做好鉴别诊断。必要时要根据实验室检测结果做出科学的诊断。

（一）鸡新城疫 鸡新城疫和传染性喉气管炎病原都是病毒，传染快，发病率高，同样有呼吸困难病状。但传染性喉气管炎无神经症状及拉稀等消化道症状。病理变化局限于喉部和气管，呈现出血性或假膜性喉炎及气管炎。

（二）鸡传染性支气管炎传染性支气管炎主要感染30日龄以内的雏鸡，也出现呼吸困难，但表现为支气管炎及肺炎病变明显。而传染性喉气管炎侵害较大日龄的鸡(4～12个月）。病变在气管及喉部，其中含大量粘液性、坏死性物质。

（三）黏膜型鸡痘如呼吸困难，口腔检查亦见喉头处被干酪样物所堵塞，病死鸡剖检可见喉头、气管栓塞等症状与传染性喉气管炎极相似。但黏膜型鸡痘在喉头处黏膜可见隆起的单个或融合在一起的灰白色痘斑。一般不见气管的急性出血性炎症。

（四）禽霍乱禽霍乱往往仅流行于个别鸡群或小范围，若在同一地区鸡鸭鹅同时大批发病死亡，则可能是禽霍乱，而不是传染性喉气管炎。禽霍乱病程短，一般在1～2 d内死亡。剖检死于禽霍乱的鸡，可见肝脏上常有灰黄色坏死点，心包膜内有大量的纤维蛋白性渗出液。全身浆膜、黏膜出血，细菌检查可检出巴氏杆菌。这些是传染性喉气管炎所不具有的。

（五）维生素A缺乏症病程呈慢性，初期咽和食道没有纤维蛋白性覆盖物，而有脓疱样小结节，在上呼吸道的上皮细胞和黏膜腺中可见角化病变，无气管急性出血性炎症变化。