FISH技术在病理蜡块操作中的应用体会

陈顺平 余英豪

现行的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术操作较为繁琐且实验结果较不稳定,我们结合自己的经验,对FISH的操作进行改进,应用过程中获得了良好杂交效果,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般材料

来源于 55例本院病理科组织蜡块标本,其中非小细胞肺癌(检测 EGFR基因)标本为 35例,浸润性乳腺癌(检测 HER-2基因)标本为 20例。主要试剂有酸性亚硫酸钠(美国 Simga产品),蛋白酶 K(美国罗氏),探针:GLP EGFR/CSP探针和 GLP HER-2/CSP17探针由北京金菩嘉公司提供。主要仪器有 Olympus BX 51型荧光显微镜、Dake原位杂交仪、电热恒温水槽、隔水式恒温培养箱。

1.2 方法

①将 3μm组织涂胶切片浸于二甲苯中脱蜡至水,用纸巾吸取多余的水分。②50℃下用 30%酸性亚硫酸钠处理组织切片 30～40min。③室温下用 2×SSC×3m in×2次漂洗。④在组织上滴上自己配制即用型蛋白酶 K,在 37℃预热的孵育盒中消化 25～35min。⑤室温下用 2×SSC×3min×2次漂洗,乙醇梯度脱水固定,自然干燥。⑥避光环境中,玻片和探针混合液(7μl杂交缓冲液、1μl去离子水和 2μl探针),探针混合液滴于杂交区域,在温度 83℃的自动杂交仪中变性 6m in后置 37℃过夜杂交。⑦洗涤:第 2日移去盖玻片,在温度 46℃,,玻片置于 2×SSC×10min×2次,2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5min。玻片干燥后加 DAPI复染液,放于暗盒中复染数分钟后用 OL YMPUSBX 51荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号。

1.3 结果判定

红色信号代表检测的靶基因,绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测 EGFR基因计数 100个细胞,统计 Ratio值(100个细胞核中红色信号数/100个细胞核中绿色信号数),FISH阳性:(1)EGFR基因扩增 ①Ratio≥2为阳性结果;②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的 10%以上;③出现成团红色信号的细胞。(2)高多体性 Ratio＜2,但≥4个红色信号的细胞数占细胞总数的 40%以上。检测 HER-2基因计数 30个,Ratio＜1.8为阴性结果,Ratio＞2.2为阳性结果,Ratio在 1.8～2.2之间时,可以选择增加计数或重做。

2 结果

55例病理蜡块标本中 48例一次性杂交成功,且杂交成功率为 87.3%。其中 2例消化不够,在 DAPI通道控制下,延长了消化时间,全部杂交成功。有 5例信号点较弱,但不影响判断。

3 讨论

FISH技术是近几年生物学领域的一项新技术,现广泛用于医学检测[1]。然而,FISH实验结果较为不稳定性且操作繁琐。通过实践,我们对病理组织进行 FISH检测的体会主要有以下几点:①酶消化方法。我们取消了国内 FISH现行的浸入消化,采用自己配制的即用型的蛋白酶 K滴入组织区域消化,37℃温箱孵育,实验取得良好的效果,克服浸入消化的不均一性。蛋白酶K容易沉淀,应及时混匀,浸入消化容易使组织标本上下区域消化不均,前后的标本消化不均,特别是标本量较大的时候,且酶用量大,成本较高,操作也繁琐。②在洗涤方面,将 2×SSC×10min代替了现行的 3遍 50%甲酰胺洗涤,对结果判断无影响,节约了时间和成本,避免了甲酰胺对身体的损害。③组织细胞类型较为复杂且大部分还伴随大量纤维,消化效果较难于控制。在进行杂交之前应在组织上滴加 DAPI复染液,在荧光显微镜下判断消化效果,组织中被杂交细胞在 RHOD和FITC的通道下,细胞核应为薄纱状,亮度一般,DAPI通道下细胞核膜应完整,颜色深浅适中,背景清晰,核外无过多杂质[2]。④判断细胞消化时,我们认为 RHOD和FITC、DAPI三通道应联合判断细胞消化效果,DAPI通道可作为判断细胞是否消化过头的首选通道,而 RHOD和 FITC的通道可作为判断细胞消化是否合适。⑤石蜡切片预处理过程很重要,每一次实验时间跟温度要统一,一般 50℃用 30%酸性亚硫酸钠处理组织切片 30～40min,时间太长或太短不利于酶消化时间的控制。⑥石蜡切片厚度一般为3μm较佳,切片过厚细胞容易聚集一起,极易造成各个细胞信号计数困难,且切片越厚预处理时间和消化时间要适当延长才不影响探针结合,使结果较为稳定。

[1] 王泊沄.病理学技术〔M〕.北京:人民卫生出版社,2000:595.

[2] 陈顺平.FISH中酶消化细胞的几点体会〔J〕.临床与实验病理学杂志,2010,26(1):116.