亚甲蓝、纳米活性炭及中华墨汁作为胃癌淋巴结示踪剂的效果比较

童朝刚 陈晓鹏

染料示踪法是淋巴结显像的主要方法之一[1],染料的选择是影响淋巴结显像效率的重要因素之一，选择理想的染料可进一步提高淋巴结检出率。国内外常用的染料示踪剂有亚甲蓝、纳米活性炭、中华墨汁等。本实验在建立鼠种植性胃癌模型基础上，应用上述几种常见染色显像剂，探讨它们在胃癌中的显像效率并进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 Walker-256肿瘤细胞株 由南京中医药大学中医药研究院提供。

1.1.2 动物 健康SD雌性大白鼠40只,鼠龄6～8周,体重140～180 g,均由南京青龙山动物繁殖场提供(批号：SCXK20060003)。

1.1.3 主要试剂 ①纳米炭混悬注射液(商品名：卡纳琳)，由重庆莱美药业有限公司生产，批准文号：国药准字H20073246。②亚甲蓝注射液，由江山济川制药有限公司生产，批准文号：国药准字H32024827。③中华墨汁原墨,北京一得阁工贸中心生产,小瓶分装经高温高压消毒后密封备用。

1.2 实验方法

1.2.1 动物胃肿瘤模型的制作方法 (1)鼠肿瘤性腹水模型的制作:将冷存的Walker-256细胞株复苏后,取0.1～0.2 ml(含细胞约106个)注入SD雌性大鼠腹腔内,清洁条件饲养,5～7 天即可形成鼠肿瘤性腹水模型。然后抽取腹水约 2 ml注入另一只大鼠腹腔，约5 d即可再次形成传代腹水模型。(2)鼠种植性胃肿瘤模型的制作:①从传代的大鼠腹腔抽取癌性腹水5 ml,呈淡红色洗肉水样,镜下可见大量瘤细胞。将抽取的腹水离心(1 000转/分)5 min，离心完成后,弃去上层淡色较清亮的癌性腹水,保留下层较浓稠呈稀糊样的半液态物，再以生理盐水调整细胞浓度为1×107个/ml,即为腹水瘤细胞悬液，于冰块上低温放置备用。②36只SD大鼠以25%乌拉坦0.4 ml/100 g腹腔麻醉,仰卧位,四肢固定于手术台上,腹部碘伏消毒取上腹正中切口，长1～1.5 cm，沿腹白线逐层进腹,无菌纱布保护切口，暴露鼠胃前壁,于胃窦区前壁近小弯侧浆膜下注入肿瘤细胞悬液约0.2 ml(勿刺破黏膜层)。拔针后,助手立即用棉签按压穿刺点2～5 min后,观察沿针道无活动性出血后,轻送胃还纳腹腔,逐层关腹,盐酸金霉素眼膏外涂防止感染。术后7天沿原切口进腹观测肿瘤的生长情况,并取少许肿瘤组织病理学检查。

1.2.2 胃癌淋巴结的染色示踪法 取36只肿瘤模型大鼠随机进入3组，即亚甲蓝组、纳米活性炭组、中华墨汁组。各组大鼠腹腔麻醉固定后，沿原切口进腹，可见胃窦区小弯侧结节型肿块，直径在0.5～1.0 cm不等，采用肿块周围4象限各注射1点的方法，每点染色剂注入量为0.1 ml，在5 s内匀速注入。然后观察各组染料到达第1、2站淋巴结的时间、淋巴结的检出枚数及褪色时间。缝合切口,分别于术后1天、14天再次进腹观察各组淋巴结褪色情况。饲养2周后处死，切取肺脏、肝脏及肾脏送病理学检查。各组动物在注射前和饲养1周后,各抽取静脉血检测谷丙转氨酶、尿素氮和肌酐。

1.3 统计学方法

每个指标经方差齐性检验后，行完全随机设计方差分析，每两组间的比较采用Student-Newman-Keuls法，所有检验的显著性水平(α)取0.05双侧,使用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 染料在胃周淋巴系统中运行的动力学指标

注入染料后，各种染色剂到达第1站淋巴结所用的平均时间，亚甲蓝组为(14.33±2.22) s,纳米活性炭组为(4.11±1.59)min、中华墨汁组为(20.00±8.53)min。染料运行至第2站淋巴结的平均时间，亚甲蓝组为(21.88±2.38) s,纳米活性炭组为(13.75±4.61)min，中华墨汁组为>1 h。记录数据经统计分析可知,不同染料间在到达1及第2站淋巴结时间上差异有统计学意义(P=0.00)，三者在显像时间上差异明显，亚甲蓝组淋巴结较活性炭组显像快(P<0.05)，但中华墨汁明显长于前两者。实验中，还观察到2例淋巴结的跳跃性转移现象，即第2、3站淋巴结先于第1站显像。

2.2 染色淋巴结的检出枚数

实验中，我们在注射染料示踪剂后每隔10 min连续观察1 h，必要时借助双目手术显微镜记数显像淋巴结的总枚数。各组检出枚数亚甲蓝组为 (7.83±1.75)枚,纳米活性炭组为(7.25±1.77)枚,中华墨汁组为 (2.17±0.84)。组间比较：亚甲蓝组与纳米活性炭组间差异无明显统计学意义(P=0.352)，即两者在淋巴结显像枚数无明显差异；但中华墨汁在实验时间内显像淋巴结数明显少于前两者(P=0.00)。

2.3 染色淋巴结的褪色时间

实验中，我们每隔10 min肉眼观察，以第1枚染色的淋巴结从着色到完全褪色的时间为褪色时间指标。亚甲蓝组淋巴结(102.08±10.74)min完全褪色，实验2 h内，活性炭组及中华墨汁组第一枚染色淋巴结均未完全褪色。术后1天再次进腹观察，活性炭组首先染色淋巴结已完全褪色，而墨汁组仍黑染。对比注射部位,亚甲蓝及活性炭组蓝染组织在14天已明显褪色,墨汁各组注射部位仍明显黑染。

2.4 不良反应

观察期间各组实验动物均无明显不良反应发生,实验前后血液学肝肾功能主要指标检查无明显变化，送检的内脏器官组织学检查也未见明显的病理学改变。

3 讨论

本实验参照文献方法[2]利用Walker-256细胞株成功地复制出种植性胃肿瘤模型,此法具有制作简便,重复性及稳定性好的优点,实验中之所以选用胃小弯侧近胃窦旁为种植部位，因为此处血液供应丰富，肿瘤细胞生长迅速，成瘤效率高,可为我们实验研究提供1种很好的胃肿瘤模型。

目前，淋巴结的示踪法主要有染料法、核素法及两者的联合应用[3]，其中染料法以其不需昂贵仪器、无放射性污染、操作简单、易于被患者接受等优点可能在我国(尤其在基层)更具有良好的推广应用前景。各种示踪法在乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌已有广泛应用并日趋成熟[4，5]。但目前在胃癌中的应用尚不多见，多在术前内镜下或术中注射染料[6]，以显示淋巴回流示踪淋巴结，指导淋巴结清扫。然而，染料的选择可直接影响显像的效率及淋巴结的清扫彻底性。常用的活性染料有亚甲蓝、专利蓝、墨汁、吲哚菁绿、微粒子活性炭等[1，7]。 好的活性染料示踪剂应具备:①淋巴组织吸收快,并能清楚显示淋巴管和淋巴结;②最好仅在淋巴结中聚积并停留较长的时间;③成本低、无毒性。几种最常使用的染料中究竟那1种最符合以上条件尚有较大争议,为之我们建立动物模型,采用统一的研究方法对它们在胃癌淋巴结中的显像效率进行系统研究。

本实验显示，注射亚甲蓝后数分钟内，胃前、后壁及小弯侧可见3～4条细小蓝染淋巴管显影,借助手术显微镜，甚至1 mm以下的淋巴结染色后都清晰可见，能满意显示胃癌周围淋巴结分布情况,增加淋巴结检出数目。根据染色情况及染色的先后顺序,在实际中可为手术根治及淋巴清扫提供条件。这与亚甲蓝的生物学特性有关[8]，其为水溶性色素，分子量小，渗透性强。局部注射后容易随水和大分子进入淋巴回流，从而显示出注射部位的淋巴引流途径。由于其良好的渗透性，淋巴结不论有无癌转移，皆可使之着色，而活性炭对于有癌栓阻塞严重的淋巴结则难以显色。此法的优点是简便易推广且较为安全,药品来源广泛，价格便宜，无需特殊处理，即可使用，但实验显示其仍存在着许多问题:染色快,色素消失也快，染色在1 h内最明显，必须在限定的时间内观察，故不适于术前内镜下染色及时间较长的手术。

纳米碳混悬注射液(CH40)在日本全国范围内广泛使用已逾十多年[9]，有大量临床应用文献报道，认为有助于提高恶性肿瘤淋巴结清扫的数量，降低局部复发率，提高生存率，而没有任何关于长期毒性的报道，国内也有类似报道[10，11]。目前，卡纳琳(商品名)为我国国内唯一上市的纳米碳混悬注射液，由重庆莱美药业有限公司生产，为活性炭经纳米技术处理，其团粒微小、均匀，平均粒径为150 nm，注射到肿瘤局部组织后，可被巨噬细胞吞噬，具有高度的淋巴系统趋向性。本组实验显示，其同亚甲蓝一样可显像淋巴结，但在到达第1、2站的时间及褪色时间上明显长于前者，其染色程度更深。实际手术中，这些黑染淋巴结的存在可刺激外科医生清扫更多的淋巴结，对重点部位进行更精细彻底的清扫；还可以提供术者视觉上的提示，避免重要血管的损伤。所以，纳米炭示踪效果较理想，但是价格上千元，限制了其应用。

我们在实验中观察到，中华墨汁扩散速度较慢,局部黑染严重，淋巴结显示效果差，因为中华墨汁是由6%碳黑+85%水和一些稳定剂制成的,碳颗粒的直径0.1～6.0 μm，大小不均匀，以大颗粒为主，局部注射后很难进入淋巴管，有些颗粒可造成淋巴管阻塞，使局部黑染严重，故示踪效果差。说明墨汁的染色效果明显不如亚甲蓝和活性炭。但国内也见报道其可用于淋巴结的示踪研究，这可能与其须调整至合适的浓度有关。

实验中，还可见显像淋巴结多位于第1、2站，提示胃癌的淋巴回流多在第1、2站，与胃癌标准的D2根治术相吻合。但部分也可见第3站淋巴结显像，甚至在显像顺序上先于1、2站，这可用来解释胃淋巴引流通路错综复杂,胃某一区域的淋巴回流并不一定按次序流经某一淋巴结,常出现跳跃转移[12]。因此，显像剂的应用对发现胃癌异常解剖部位的“跳跃性”转移淋巴结,指导胃癌手术切除范围有重要意义。

综上所述，亚甲蓝和活性炭在胃癌的淋巴结显像效率上相仿，可作为淋巴结的示踪剂，指导术中淋巴结的清扫范围，但两者各具优缺点，染、褪色时间上存在差异，提供给术者的时间活性炭要长于亚甲蓝。中华墨汁的显像效果不如前两者。

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