尿道致病性大肠埃希菌Afa/Dra家族黏附素afa/draC基因的扩增与分析

宫艳格,刘德梦

(天津医科大学第二医院感染性疾病研究所,天津 300211)

尿道致病性大肠埃希菌是引起泌尿系统感染常见且重要的致病菌。黏附素在介导泌尿系统感染过程中发挥重要作用。在目前发现的大肠埃希菌多种黏附素中,Afa/Dra家族黏附素中的 Dra黏附素与30%～50%膀胱炎、青年女性复发性泌尿系统感染密切相关,携带Dra黏附素的大肠埃希菌有形成慢性和复发性感染的倾向[1,2]。2008年 7月～2009年7月,我们对大肠埃希菌Afa/Dra家族黏附素进行研究,为大肠埃希菌的生物学治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 尿道致病性大肠埃希菌及受体菌来源 收集我院近 1年反复发作性泌尿系统感染患者尿标本中分离出的大肠埃希菌 50株,经常规生化及血清学鉴定确定为尿道致病性大肠埃希菌。afa/draC基因阳性对照菌株AAEC191A(pCC90)由美国华盛顿大学 Steve Moseley教授惠赠,克隆受体菌 E.Coli DH5a由扬州大学畜禽病原微生物研究室朱国强教授惠赠。

1.1.2 PCR引物 afa-f:CGGCTTTTCTGCTG AACTGGCAGGC,afa-r:CCGTCAGCCCCCACGGCAG ACC[3]。引物序列由上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要仪器及试剂 Mastercycler personal PCR仪(eppendorf公司),GELDOG-200型凝胶成像系统(美国B IO-RAD公司),Taq DNA聚合酶 (大连TaKaRa生物工程公司)。选择培养基为在LB固体培养基中加入氨苄青霉素 (终浓度 100 mg/ml)、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 (X-gal,终浓度 40 mg/ ml)、异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG,终浓度 24 mg/ml)制成,PCR产物纯化试剂盒及 T(pUCm-T载体)-A克隆试剂盒(上海生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 ①煮沸法制备基因组 DNA。②PCR扩增:10×PCR buffer 2.5 ml,dNTP 250 mmol/ ml,afa-f 30 pmol/L,afa-r 30 pmol/L,Taq DNA聚合酶 0.025 U/ml,DNA模板 2 ml,去离子水 16.875 ml。PCR反应条件:预变性 94℃4 min,变性 94℃30 s,退火 53℃30 s,延伸 72℃1 min,共 30个循环,延伸 72℃8 min,4℃保存。③PCR产物分析: 1%琼脂糖凝胶电泳,如果出现明显的 672 bp亮带可能为阳性菌株。

1.2.2 克隆 ①感受态细胞的制备:用 0.1 mmol/ L的 CaCl2制备感受态细胞。②纯化:按照 PCR产物纯化试剂盒步骤对 PCR产物进行纯化。③PCR产物与 T-载体连接反应体系:1 ml 10×Ligation Buffer,1 ml 50%PEG,1 ml pUCm-T载体,2 ml纯化后的 PCR产物,4 ml无菌水,1 ml T4 DNA Ligase。19℃水浴过夜。④转化受体菌 E.ColiDH5a:取 8 ml PCR产物与 T-载体连接混合物至新制备的 100 μl感受态细胞中,冰上放置 30 min后迅速转移至42℃水浴 1.5 min,冰上放置 5 min,加入 400 ml LB培养基,37℃下 250 r/min离心 60 min。⑤筛选重组子:将恢复正常生长的转化后细菌 4 000 r/min离心 5 min,弃上清 400 ml,利用剩余培养基重悬细菌后取 70 ml涂布于含氨苄青霉素的选择性培养基上,过夜培养,观察结果,白色菌落为阳性重组子,蓝色菌落为阴性重组子。⑥鉴定重组子:分别将白、蓝色菌落接种于含有氨苄青霉素 (100 mg/ml)的 LB液体培养基中,37℃震荡培养 16～18 h后,用质粒提取试剂盒提取质粒,并在 2%琼脂糖凝胶上电泳分析,观察两种颜色细菌质粒大小的差别,以所提取质粒为DNA模板进行 PCR扩增,并对白色菌落的质粒及其 PCR产物进行测序。测序结果由上海生物工程有限公司提供。

2 结果

2.1 扩增结果 有 20株菌琼脂糖凝胶电泳出现单一条带基因片段,大小同阳性对照菌的 afa/draC基因片段大小(672 bp)相符。

2.2 克隆结果 将以上阳性菌株的 PCR产物分别进行 T-A克隆后筛选培养基上生长出蓝色、白色菌落。T-A克隆所用pUCm质粒的大小为2 773 bp,克隆后质粒的大小为 3 445 bp。白色菌落和蓝色菌落的质粒所在凝胶的位置分别与 3 445 bp和 2 773 bp的位置相符。

2.3 测序结果 以上述 20株 afa/draC基因片段的阳性克隆菌的质粒为模板的 PCR产物纯化后送上海生物有限公司进行测序。与 GenBank AF329316.1的基因序列进行比对,发现阳性对照菌pCC90的该段基因序列与 GenBank所示完全一致; 20株临床分离株的 afa/draC基因序列与阳性对照株 pCC90对比具有高度同源性 (大于 99%),其中分别存在 3～4处点突变,分别在第 284(2 837)、第308(2 861)、第 600(3 153)、第 620(3 173)位点。应用 Primer Premier 5软件,将菌株 E.Coli329 afa/ draC基因片段测序所得基因序列翻译成对应的氨基酸序列并与标准菌株 pCC90的氨基酸序列比对,结果发现突变位点所对应的氨基酸部分发生改变,其中第 284(2 837)位点 (G变为 T)与 第 308 (2 861)位点(T变为 C)的突变并没有导致氨基酸序列发生改变,而第 600(3 153)位点 (T变为 C)与第 620(3 173)位点 (C变成 G)的突变则分别导致氨基酸序列第 184位丝氨酸(Ser)被脯氨酸(Pro)取代,第 206位组氨酸 (His)变成谷氨酰胺 (Gln或Q)。

3 讨论

Afa/Dra家族黏附素是大肠埃希菌的主要黏附素之一,在介导大肠埃希菌与宿主细胞之间的黏附过程中发挥重要作用。携带Dra黏附素的大肠埃希菌对 HeLa细胞具有很强的侵袭力[4]。其特异性受体包括衰变加速因子、Ⅳ型胶原和癌胚抗原及癌胚抗原相关细胞黏附分子,该家族黏附素即通过与相应特异性受体的结合而使细菌定植于表面并由细胞的内摄作用进入宿主细胞引起炎症反应。该家族黏附素基因至少有 5个基因片段组成,其中 C基因长2 580 bp,编码引导蛋白,与周浆蛋白一起辅助黏附蛋白到达细菌表面 (即周浆—伴侣途径)。鉴于afa/draC基因片段具有高度的同源性,故该实验针对 afa/draC基因片段设计引物,并对 PCR产物克隆后进行克隆子序列分析。

本试验从 50株临床分离的尿道致病性大肠埃希菌中筛选出 20株 afa/draC基因阳性菌,PCR扩增后进行克隆测序,测序结果显示临床分离菌株的afa/draC基因序列与 GenBank及阳性对照株 pCC90对比具有高度同源性,所测菌株均存在 3～4个点突变,由于该扩增片段长度 (672 bp)只占 afa/draC全基因序列长度 (2 580 bp)的 26.05%,据此推测 afa/ draC全基因序列内可能还存在其他位点突变。本次测序菌株的该基因片段突变位点高度一致,应用Primer Premier 5软件分析比对上述测序结果与所对应的氨基酸序列,发现突变位点所对应的氨基酸部分发生改变。

由于上述基因片断点突变的高度一致性及所对应的氨基酸部分发生改变,推测大肠埃希菌 afa/ draC基因位点的突变极有可能由于地区差异所致的基因位点变异,这种变异可能不会影响蛋白质的结构和功能。但这一推测有待进一步研究证实。

[1]Germani Y,Béaud E,Duval P,et al.Prevalence of enteropathogenic,enteroaggregative,and diffusely adherent Escherichia coliamongisolates from children with diarrhea inNew Caledonia[J].J InfectDis,1996,174(5):1124-1126.

[2]Foxman B,ZhangL,Tallman P,et al.Virulence characteristics of Escherichia coli causing first urinary tract infection predict risk of second infection[J].J InfectDis,1995,172(6):1536-1541.

[3]Le Bouguénec C,LaliouiL,duMerle L,et al.Characterization of AfaE adhesins produced by extraintestinal and intestinal human Escherichia coli isolates:PCR assays for detection of Afa adhesins that do or do not recognize Dr blood group antigens[J].J ClinMicrobiol,2001,39(5):1738-1745.

[4]Goluszko P,NieselD,NowickiB,et al.Droperon-associated invasiveness of Escherichia coli from pregnant patientswith pyelonephritis[J].Infect I mmun,2001,69(7):4678-4680.