动物活体光学成像的应用进展

余松涛,黎 川,陈 陵,汤旭东,房殿春,杨仕明

(第三军医大学西南医院全军消化病研究所,重庆,400038)

随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入,人类对疾病和对生命本质的认识不断被追朔到蛋白质、基因水平。在上个世纪发展起来的CT、MRI、PFT、超声等宏观影像技术已经远不能满足对活体环境内细微生命过程的探询。组织切片和免疫染色能够部分解释一些生物现象,但是需要研究对象与活体组织的分离,所得结果与其在活体内机制难免有所偏离,甚至完全相反。荧光染料(fluorescent dye)能对多种细胞共价标记并进行活体显像,但多被限制于体外培养的细胞。其化学毒性和对活体内环境的化学干扰使其在活体应用受到极大限制。荧光蛋白和萤光素酶作为具有生物活性的蛋白质,在活体内无毒、无放射损伤、可代谢、可穿过各种膜屏障。它们的编码基因片段小,可以被融合标记于绝大多数蛋白质和细胞,甚至可以对整个生物体进行全身背景标记。在不影响生物体任何结构和功能的前提下,这些荧光基团配合外部检测设备可以对各种体内生物现象进行实时活体显像。

1 荧光与生物发光

目前医学研究应用得最多的荧光基团实际上包括激发荧光蛋白所得到的荧光和体内化学反应所得的生物发光两类:天然荧光蛋白经一定波长的激发光照射后发出的光叫荧光(Fluorescence);萤光素酶催化相应底物发生化学反应产生的萤光叫生物发光(bioluminescence),实质上是一种化学发光。

1.1 荧光蛋白及其应用

荧光是指某些特殊物质如荧光蛋白经特定波长的激发光(入射光,通常是短波高能的紫外线)照射,吸收光能后由基态进入激发态、并立即返回基态,同时发出比入射光波长更长的发射光(出射光,通常是长波低能的红外或可见光)。这种发光具有瞬时性。激发光一旦停止照射出射光随即停止。自然界的荧光蛋白有很多种。最初被人类发现的是绿色荧光蛋白(GFP),由Chalfic等1994年从维多利亚水母(Aequorea Victoria)发光现象中分离纯化出的基因[1-2]。近年来一些新发现的具有长波长发射谱的天然荧光蛋白或人工突变体被广泛应用于生物医学研究[3-5]。

美国抗癌研究所Hoffman等[6]长期以来利用荧光蛋白进行各种活体成像的探索。他们构建了多种全身表达荧光蛋白的转基因动物,将待研究肿瘤细胞标记上的其他颜色的荧光蛋白植入体内不同部位,在宏观范围活体观察肿瘤的增殖,侵袭,转移,极其与血管系统和免疫系统的相互作用[7]。在微观活体单个细胞水平观察亚细胞生物事件时,有学者在体表半分离一带蒂皮瓣(reversible skin-flap widow),使其既有血供,又能被拉伸成为半透明组织,供高敏CCD探头观察其内被标记的细胞结构[8-11]。

近年来,在同一活体生物利用两种颜色的荧光蛋白标记不同组织或同一细胞内不同结构,研究各种细胞-细胞、细胞-血管、激素-受体等相互作用生物过程,已经得到成熟应用[12-14]。hoffman等[15]用GFP和RFP分别标记不同亚系的人纤维肉瘤细胞HT1080,静脉注射后观察其在肺的转移灶荧光。通过对纯红和纯绿的光团计数,得到不同亚系的转移能力和肿瘤细胞之间相互作用的影像学资料。在另一实验中,他们将全身表达GFP的小鼠体内植入表达 RFP的肿瘤细胞[15],在4～8周的时间跨度内观察了肿瘤与宿主血管、淋巴细胞、纤维细胞、巨噬细胞、DC细胞的相互作用。同样的,凝血因子[16]、免疫细胞[17]等也可以用荧光蛋白标记,对其在其内的生物学行为和调控反应进行成像。

1.2 生物发光和萤光素酶[18]

1.2.1 萤光素酶生物发光系统:生物发光过程本质是一种化学反应。生物体内的萤光素酶催化相应的底物发生化学反应发出的波长介于500～700 nm之间的生物光(bioluminescence),也被称为荧光。自然界有无数种类似的萤光素酶-底物荧光发生系统。最受生物医学领域关注的是细菌发光和海洋生物发光。这些生物体内都含有Lux发光基因操纵子,同时表达萤光素酶及其底物,不需要外源底物即可发光。应用于实验动物的生物发光系统有北美萤火虫萤光素酶[19](North America firefly luciferase,Fluc)和海肾萤光素酶(renilla luciferase,Rluc)及其底物。萤光素酶产生的生物发光主要特点是不需激发光而需要底物和氧气。其波长比荧光蛋白发出的荧光长,穿透组织能力相应更强。由于不需要激发光,能够避免由激发光产生的动物皮毛,组织和粪便的自发荧光干扰。Fluc和Rluc的底物分别是荧光素(D-luciferin)和腔肠素(coelentarizine)。前者的荧光波长540～600 nm,组织吸收和散射较少[20],而后者荧光波长460～540 nm,组织吸收多且体内代谢快[21]。因此很多活体实验采用Fluc作为报告基因,而Rluc作为荧光强度的标准参照。不仅如此,两种底物对胞膜通透性也不一样,Fluc的水溶性和脂溶性都非常好,易穿透细胞膜或血脑、胎盘屏障[22～23];而Rluc在胞浆内被一种广谱耐药糖蛋白MDR1识别并转运至胞外,因此很难达到细胞浆内[24]。

1.2.2 生物发光在病原体研究和感染性疾病中的应用:生物发光技术可以用来研究大分子、细胞、细菌、病毒在机体内的生物学行为。1995年,Contag等[25]首次采用萤光素酶标记沙门氏菌,评价了不同亚系菌株在小鼠体内的毒力。此后几十种细菌被萤光素酶标记,以研究感染疾病的发病机理和治疗反应。目前标记细菌主要采用两种策略,一种是直接将Lux操纵子插入细菌染色体中,但这种方法不能运用于高等生物。另一种方法将萤光素酶编码基因插入病原菌染色体,然后宿主动物全身给予底物,此法应用最为广泛。发光菌Lux基因操纵子和海肾萤光素酶产生的荧光波长都在500 nm左右。而萤火虫萤光素酶产生的荧光波长在600 nm左右。使用合适的波长滤光器即可区分这两种波长荧光,从而达到同时对多种报告基因定位和定量。Hutchens等[26]尝试了两种萤光素酶同时显像。他们在全身表达Fluc的转基因小鼠体内注入带有Lux操纵子的肺炎链球菌,观察了细菌在或体内的致病和治疗反应。萤光素酶还可以和绿色荧光蛋白或PET报告蛋白结合显像。Yaghoubi等[27]用萤光素酶和荧光蛋白、PFT报告蛋白共标记Ⅱ型胶原特异性T细胞,并观察了这种关节炎与胶原的关联特征。以IRES连接后融合表达的双报告基因一般都有 IRES下游报告基因表达衰减倾向。Wang[28]等人用十个串联的同源结构域蛋白修饰IRES(SIRES),并用此SIRES链接萤光素酶和PET报告基因,发现SIRES下游PET报告基因的表达大大增强。Venisnik等[29]还将萤光素酶融合到抗癌胚抗原(CEA)抗体上在活体内针对CEA阳性肿瘤达到非常精细的成像。

1.2.3 生物发光在肿瘤研究中的应用:生物发光在肿瘤研究中最直接的应用是将萤光素酶基因体外标记肿瘤细胞,再经皮下成瘤、或原位移植瘤,观察原发肿瘤的血管侵袭、迁移等一系列生物特征。萤光素酶也可以和荧光蛋白联合应用,分别标记不同细胞在同一活体内显像,或标记同种细胞不同亚细胞结构。根据发光是否与底物导入有关将两种报告基因区分开。Edinger等[30]将萤光素酶和荧光蛋白同时标记的淋巴瘤细胞植入小鼠后观察了其在体内的定殖,扩张,转移,以及其对放疗,化疗和免疫治疗的反应。他们还将NK-T细胞标记并观察了其进入并杀伤肿瘤组织的全过程。Catherine等[31]将GFP和萤光素酶同时标记的小鼠肝癌模型,并对myc癌基因进行失活,观察到失活myc后肝癌细胞向正常干细胞分化并开始表达正常干细胞的标志物。再激活myc后细胞又转向癌细胞分化。Stathopoulos等[32]用绿色荧光蛋白和萤光素酶双报告基因标记的lewis肺癌细胞静脉注射小鼠,发现体外检测到的肺部荧光强度和肺表面癌胞数成正相关。他们还将这种lewis肺癌细胞直接注射到小鼠胸膜内,活体观察了小鼠的胸腔积液特点。

萤光素酶的缺点主要表现在底物的导入对设备和技术的要求。其次是萤光素酶催化底物发生的反应是需氧反应,因此在缺氧组织的报告基因多有失真现象。Cecic等曾就此将萤光素酶与lacZ报告系统在缺氧肿瘤组织中做过对比[33],发现缺氧组织中萤光素酶报告存在失真现象。

2 几种相关技术

2.1 CCD相机与小动物整体成像

目前使用的活体小动物整体成像设备多使用背部薄化、背照射的冷CCD照相机(charge coupled device cameras)[34]。CCD技术上分为前照射和背照射。前照射型在光信号和CCD芯片之间有一层多硅层和二氧化硅层,减少了CCD的量子效率,光信号衰减而小于理论值。而背部薄化、背照射的冷CCD照相机(back-thinned and backilluminated)将多硅层和二氧化硅层去掉,能够检查到深层活体组织发出的极为微弱的荧光。但同时提高了成本,也失去了多硅层和二氧化硅层对于芯片的保护作用。因此一般体外细胞实验都使用前照射CCD,只有在整体动物成像或对极微弱荧光成像时才采用背照射。

小动物整体荧光成像时,动物被麻醉后放置在绝对密闭暗箱内的可调平台上。在普通光照下拍摄一次背景照片,再用CCD拍摄荧光图像。软件叠加后得到整体小动物体内的荧光图像。如果对于某些部位的荧光有较高的分辨率和精细度要求,则打开一个外科的体表皮瓣窗(skin-flap window)以减小荧光从组织到达探头的距离,提高检出的荧光强度。针对荧光蛋白的小动物整体成像责需要激发光发生器及滤波器,发射光滤波器和CCD探头组成。对于不同的荧光蛋白,不同波长的激发光经过滤波器照射到动物活体组织,激发的发射光又经可调波长的发射滤波器后到达探头。激发光装置一再简化,目前甚至最简单的LED闪光灯都可以用于荧光蛋白的整体成像[35]。最近应用的光谱显像(spectral imaging)是一种能够将自发荧光和标记荧光分辨开来的显像模式。在常规光学镜头前加一个低温单色摄像头和液晶可调滤光器。然后从500到650nm发射光波谱每10 nm取一张图,按顺序排列为光谱序列图,用软件将这些光谱序列图和RFP或GFP自发荧光光谱进行对照分析后可以得到光谱图像[7]。这种光谱显像最为显著的优点是大大减小了皮毛和组织自发荧光的干扰。目前常用的整体/显微多用途荧光成像系统有OV100(Olympus Optical,德国),eXplore Optix(NIR)系统(General Electrics Healthcare,加拿大),和 Xenogen IVIS系统(Xenogen Corporation,Hopkinton,美国),MaestroTM系统(Cambridge Research&Instrumentation,CRI)[36]。Alencar等[51]开发了一种针尖物镜头深入到组织内部。其时间,空间和波长分辨率都很好。hoffman等用这种配备针尖物镜的激光显微镜对活体内细胞成像,观察到高度清晰的肿瘤细胞和宿主细胞相互作用的显微图片[37]。

2.2 多光子成像技术

多光子显微镜是近年来应用最广泛的活体弱荧光检测技术。单光子激发情况下,激发光多需要紫外光。双光子激发时采用两个红外光子同时激发荧光基团。这种长波的激发光能够很好的穿透组织且损伤极小,提高了活体显像的体层深度,延长了活体样本的耐受时间。此外,双光子荧光激发只发生在焦点平面,减少了焦点外的伪影干扰。降低紫外光用量也降低了对光学元件的限制[38]。综合起来,双光子显微镜具有以下几个优点[39]:①具有高空间局域性和高分辨率;②双光子激发的发射荧光波长远离激发波长,避免了激发光对发射光的干扰,能实现暗场成像。同时散射产生的背景噪声小,图像对比度高;③焦点以外不发生光漂白现象;④激发光源采用红外光,能对生物组织的深层成像。

同一种荧光基团在吸收单个光子和吸收双光子的情况下激发情况不同。有的基团在吸收单光子时不发出荧光而在吸收双光子时发出荧光。因此通过控制体外激发光波长可以达到对体内特定的荧光基团进行光控开关[40]。这种激发光控制分子荧光开关技术用于活体荧光显像,可以获得焦平面15 nm的分辨率,对亚细胞结构很好分辨率。极低的组织损伤使得很多瞬时的生物过程得以长时观察。如肾滤过[41],胶质细胞突触形成[42],免疫系统[43],钙质代谢[44]等。

2.3 活体的断层荧光成像与三维荧光重建

在某种均一生物组织中,体层内部荧光穿过组织细胞时都有一定的吸收。在体表探测到的荧光衰减的量,和组织厚度密度成正比。由此根据一定的算法就可以得出体表某一点荧光的实际体层深度。把各点的深度得出后就可以得到动物各个体层的荧光断层图像(fluorescence molecular tomography,FMT)[45-46]。这种三维荧光活体成像技术至少需要三项参数:测量组织的光学特性;预测特定光源下模型动物体表的光强度分布特点;软件重建组织深度和荧光能量。该技术最初只能在非生物的假动物模型中模拟,Zacharakis等[47]首次使用活体小鼠进行了三维活体显像。Comsa等[48]用扩散近似值法先从普通活体荧光成像中获得两种图像:一种反射图像来得到实验动物的组织光学特性,一种荧光发射图像来重建组织深度和荧光能量。使用同样方法他们在处死后小鼠体内植入的点光源进行了荧光三维重建[49]。最初的荧光活体三维重建技术都是基于理想化的密度均一组织,Virostko等[50]将点光源植入小鼠腹腔,首次研究了非均质组织的光学特性和三维荧光重建的准确率。Alexandrakis等[51]用 PET先对小鼠作高清晰的立体解剖图,将各层光学特性用PET数据记载下来。精确计算了荧光在各层组织中的衰减率,同时可以测算特定深度所需的最低组织光学特性精确度。也可以先用多角度结构光将小鼠表面立体重建,弥散近似法计算荧光的组织衰减。这种方法对单次成像成像的表面荧光图像重建后可以获得高度清晰的3-D荧光图像[52]。这种方法已经在小鼠前列腺肿瘤细胞活体三维成像中得到应用。Garofalakis等[53]用旋转的载物架和CCD相机得到不同旋转位置的小鼠体内荧光图像,软件重建之后将小鼠脾内3×105个表达绿色荧光蛋白的T淋巴细胞团立体显影。Montet等[54]将小鼠体内荧光标记的大肠癌肿瘤血管进行体层显像,观察到了各种促血管信号通路阻断后对血管生成的影响,以及抗血管生成治疗手段的疗效。Huang[55]最近发表在Science上的文章报道了一种称为STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)的3D荧光显微系统[55]。这种系统可以达到最高平面分辨率为20～30 nm,轴向分辨率50～60 nm。基本可以对细胞内部荧光基团进行立体显像。目前不管是宏观的还是微观的立体显微镜都不能对或体内的生物现象进行长时观察。Vinegoni等[56]在Nature上报道了一种介观(mesoscopic)显微系统。能够在介于宏观和微观之间(纳米和毫米之间)对果蝇蛹的形态学变化进行长时间荧光断面和立体成像,观察其生长发育和对环境药物等刺激的反应。

基因和蛋白质功能的研究,各种信号通路、肿瘤靶向技术和免疫机理研究都离不开生物的活体环境。活体荧光成像相关的一系列技术目前致力于扩大标记靶标的范围、增加检测的敏感性、减小报告子对活体环境的干扰、提高对活体环境的模拟水平。随着DNA及蛋白质靶向技术,三维荧光技术、多光子技术的逐渐成熟,整体活动物内的细胞分子水平研究已经取代了离体的、无生命的研究时代。在弱荧光检测硬件的推动下,活体生物内部世界更多秘密将会被我们用眼睛看到。

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