肾透明细胞癌NOTCH1与JAG1的表达及意义

吴科荣 张立 许乐 侯君* 程跃 李和明 谢国海 严泽军 蒋照辉

(1.浙江省宁波市第一医院泌尿外科,浙江宁波 315010;2.复旦大学附属中山医院泌尿外科,*病理科,上海 200032)

肾透明细胞癌是泌尿系统最重要的恶性肿瘤之一,已经证实其发生发展与Von Hippel-Lindau(VHL)抑癌基因失活有关。以此理论为基础针对血管内皮生长因子(VEGF)受体的分子靶向治疗目前已经成为转移性肾癌的一线治疗,但其仍然存在着有效率低、不良反应明显等缺点[1-3]。随着对肾癌分子基因的进一步了解,有更多的信号通路进入人们的视线,通过对这些通路的研究,不仅可以进一步了解肾癌的发病机制,而且可能提供其他的治疗靶点。Notch通路是进化上十分保守的通路,其在细胞一系列的生理活动(包括细胞分化、增殖、凋亡、粘附、迁移及血管形成等)中都起到了十分重要的作用,而异常的Notch信号途径与许多肿瘤的发生有关[4-6]。Notch通路与肾癌的关系尚不十分明确。本研究应用免疫组织化学染色法检测跨膜受体蛋白(NOTCH1)和Jagged1基因(JAG1)在肾癌组织及正常肾组织中的表达,并探讨其表达与临床病理特征的关系以及NOTCH1与JAG1作为肾癌生物学指标的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2003—2008年在复旦大学附属中山医院行肾癌手术,术后病理证实为肾透明细胞癌的患者129例。其中男性84例,女性45例;年龄27～83岁,平均55.5岁。手术方式:肾根治术122例(94.6%),肾部分切除术7例(5.4%)。肿瘤按TNM(2002 AJCC)分期:Ⅰ期81例,Ⅱ期17例,Ⅲ期24例,Ⅳ期7例。按Fuhrman分级:1级53例,2级54例,3级18例,4级4例。肿瘤大小1.5～15 cm,平均 5.3 cm。129例中有 37例(28.7%)肿瘤复发,92例(71.3%)未发现肿瘤复发。取正常肾组织33例作为对照。所有组织标本采用10%甲醛固定,石蜡包埋,5μm连续切片。

1.2 主要试剂 一抗:兔抗人NOTCH 1多克隆抗体(ab27526)(购自 Abcam,UK);羊抗人JAG1多克隆抗体 (sc-6011)(购自Santa Cruz,USA)。二抗:羊抗兔抗体(购自上海长岛);兔抗羊抗体(购自北京中衫金桥)。

1.3 免疫组化染色 采用EV二步法染色,石蜡切片60℃烘烤,常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水;3%新鲜双氧水避光孵育30 min灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤;热抗原修复(抗原修复液为p H 6.0枸橼酸盐缓冲液);滴加一抗,室温下孵育1 h,pH 7.4的PBS洗涤3次,滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h后,PBS洗涤3次,DAB显色,苏木素复染,干燥后中性树胶封片。用已知乳腺导管癌阳性切片做阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 染色结果判定 所有的染色片均由3位观察者独立评价,这3位观察者对病例的信息均无任何了解。染色强度和染色程度的评价依据为既往的文献[7]报道:先在低倍镜下随机选择3个视野(×40),计数100个肿瘤细胞阳性百分比,定义无细胞染色为阴性,1%～20%细胞染色为1分,21%～60%细胞染色为2分,61%～100%细胞染色为3分。然后通过观察高倍镜(×200)下肿瘤细胞染色强度,定义不着色为0分,浅棕黄色为1分,棕黄色为2分,深褐色为3分。免疫染色评分(immunoreactive score)为上述2项指标之和,定义0～3分为蛋白低表达,4～6分为蛋白高表达。

1.5 统计学分析 所有数据均选用SPSS 11.5软件行统计学分析。相关性检验采用卡方检验和Spearman相关分析,检验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肾癌及正常肾组织中NOTCH 1、JAG1的表达 NOTCH 1、JAG1在肾癌组织中免疫组化染色主要表现为肿瘤细胞胞膜染色和(或)胞浆染色,小部分肿瘤细胞核亦染色(图1、2)。NOTCH 1、JAG1在正常肾组织中的阳性表达率分别为36.4%(12/33)、42.4%(14/33),在肾癌中的阳性表达率分别为 95.3%(123/129)、93.0%(120/129),差异均有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 NOTCH 1与JAG1的表达相关性 用免疫染色评分判断2个蛋白的表达。Spearman相关分析显示:NOTCH 1表达和JAG1表达呈正相关(r=0.384,P＜0.001)。

2.3 NOTCH 1、JAG1表达与肾癌临床病理的相关性 随着肾癌病理分级和临床分期的增高,NOTCH1和JAG1的表达水平均增高(P＜0.05)。NOTCH1和JAG1的表达水平还与肿瘤大小有关,在直径≥5 cm肿瘤中的表达高于在直径＜5 cm肿瘤中的表达(P＜0.05)。复发组 NOTCH 1和JAG1蛋白的表达水平均高于未复发组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。两者的表达水平在不同年龄和不同性别的病例中无显著差异(表1)。

表1 NOTCH1、JAG1的表达与临床病理参数间的关系(例)

3 讨 论

Notch广泛表达于从无脊椎动物到哺乳动物等多个物种,是一个在进化上十分保守的跨膜受体蛋白家族。Notch最早在T急性淋巴细胞白血病(TALL)研究中受到关注。在 T-ALL患者中存在 t(7;9)(q34;q34.3)染色体异位;尽管另外一部分病例不存在这种染色体异位现象,但Notch信号过度表达却很常见[8]。

已经发现Notch通路在乳腺癌的发生发展中起着“促进”的作用:Notch通路的组成蛋白,尤其是NOTCH1与JAG1高表达,并且这种高表达往往提示乳腺癌患者的预后不良[9]。有报道JAG1在转移性前列腺癌中的表达明显高于在局限性前列腺癌中的表达,并且其表达水平高低与肿瘤复发有关:JAG1高表达的前列腺癌病例的肿瘤复发概率比JAG1低表达的前列腺癌病例高。

目前Notch与肾癌的关系尚不十分明确。Sun等[10]的研究结果显示Notch在肾透明细胞癌中低表达。然而有学者[11-12]发现肾透明细胞癌中NOTCH3、JAG1表达增加。Nilay等[13]研究结果显示Notch在透明细胞癌中的表达是在正常肾组织表达的9倍。Sjölund等[14]则在肾透明细胞癌细胞株中测得Notch通路各组成蛋白存在并且高表达,并且这种表达相对独立于经典通路中VH L、HIF-1a、HIF-2a的表达;Notch通路各组成蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达高于在正常肾组织中的表达,其中又以NOTCH 1和JAG1最为显著。

本研究发现肾透明细胞癌组织NOTCH1与JAG1阳性表达率高于正常肾组织。而随着肾癌的病理分级、临床分期的增高和肿瘤的增大,NOTCH1和JAG1的表达水平均增高。本研究结果提示Notch通路与肾透明细胞癌的密切联系:Notch高表达可能与肾透明细胞癌发生发展有关。复发组NOTCH 1和JAG1蛋白的阳性表达率均高于未复发组,提示两者对临床预后判断可能具有一定价值。

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