巴西蘑菇液体培养及胞外多糖积累研究

郑树生，梁丽琨，倪新江

（1.黑龙江八一农垦大学测试中心，黑龙江 大庆 163319；2.山东烟台大学生物理工学院，山东 烟台 264005）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murvill）原产于北美南部和南美北部等地，具有浓郁的杏仁香味，含有丰富的蛋白质和氨基酸，特别是促进儿童生长发育和增加智力的精氨酸和赖氨酸，氨基酸总量占干重的21.37%，必须氨基酸占氨基酸总量39.7%，此外还含有多糖、甾类等生理活性物质，是一种食药兼用的珍稀食用菌，其多糖含量位于食用菌之首。巴西蘑菇多糖具有抑制肿瘤、降低血脂、抗癌、抗凝血等功效，可提高肌体免疫力，预防心脑血管疾病。日本三重大学医学部冈本丈博士对巴西蘑菇多糖的抗癌性进行详细研究，结果表明，巴西蘑菇多糖对移植到小鼠体内的多形细胞肉瘤细胞的全治率（生存率）和阻止率是最高的，达90%，而灵芝最低，仅20%。该结论得到东京大学医学部、日本国立癌症中心研究所、东京药科大学证实[1]。

由于巴西蘑菇的栽培条件要求较苛刻，而且国内对其栽培研究起步较晚，作为商品进行生产和销售的很少，因此价格较高。研究表明巴西蘑菇液体培养菌丝体的蛋白质、多糖等成分的含量与子实体相当，但生产周期却大大缩短，有利于巴西蘑菇功能食品及抗癌药物的生产。本试验选用了成本低、来源广的天然材料作为液体培养基原料，研究了不同培养基中巴西蘑菇菌丝体和胞外多糖的积累，得到了适合巴西蘑菇菌丝生长并积累丰富胞外多糖的液体培养基配方，为更好的开发和利用巴西蘑菇资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

巴西蘑菇1号菌种，本实验室保藏。

1.2 培养基

基础液体培养基：葡萄糖3%、蛋白胨2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、VB 110 mg·100 mL－1。

母种培养基：金针菇菌糠（煮汁）20%、葡萄糖2.0%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.01%、琼脂2%。

供试碳源：发酵棉籽壳、马铃薯、蔗糖、小麦粉、玉米粉、地瓜粉。

供试氮源：麸皮、黄豆粉、硫酸铵、尿素。供试生长因子：巴西蘑菇菌糠煮汁、酵母粉。有机天然碳（碳源添加0.1%的α－淀粉酶）、氮源均煮1 h，过滤备用。

1.3 培养方法

取活化菌种3～4块接种于母种培养基平板上，25～28℃培养3～5 d，无菌打孔器打孔，切取尖端菌丝，用接种铲将菌种薄片接种于含50 mL液体培养基的300 mL三角瓶中，每瓶3块，使菌种块漂浮于液体表面，25～28℃静止培养48 h，待菌丝萌发后，25～28 ℃，130 r·min－1，摇床培养 7 d。

1.4 生物量的测定

1.4.1 菌丝球计数

将发酵液倒人培养皿中摊匀，取出菌种块，培养皿下垫方格纸，方格法计数。

1.4.2 菌丝干重测定

沟通了上面的意思，我说：“这样的问题，你不用解释，也没办法解释。任何解释都会使问题变得更加麻烦。只要你态度明确毫不含糊地说‘不’，就是对她对你最好的负责任的表现，相信女孩会很快地调整好自己的情绪。当然，如果‘是’，就另当别论了。”

纱布过滤得菌丝球，并用蒸馏水洗涤3次，60℃烘至恒重。

1.5 胞外多糖的提取与测定

1.5.1 胞外多糖的提取

发酵液 4 000 r·min－1离心 15 min，去沉淀，加入3倍体积95%乙醇，0～4℃冰箱醇析24 h，离心弃上清液，95%乙醇洗涤2次，加入10倍体积的蒸馏水，80℃水浴溶解，4 000 r·min－1离心15 min，去沉淀，得多糖上清液。

1.5.2 Sevag法除蛋白

在多糖水溶液中加入等体积的Sevag试剂（正丁醇：四氯化碳=4：1），于125 mL分液漏斗中，振荡后静置分层，取下层液体，重复1～2次，直至上层有机相澄清为止。

1.5.3 多糖的测定

处理后的多糖溶液，100 mL容量瓶定容，用苯酚硫酸法测定多糖含量[2]。

2 结果与分析

2.1 最佳液体培养时间确定

图1 姬松茸液体培养菌丝体生长曲线Fig.1 Growth curve of mycelium in submerged culture of Agaricus blazei

2.2 不同碳源对菌丝生物量和胞外多糖产量的影响

分别用葡萄糖、发酵棉籽壳、蔗糖、玉米粉、小麦粉、地瓜粉、马铃薯替代基础液体培养基中的葡萄糖，25～28℃摇床培养7 d，测定生物量和胞外多糖含量，结果见表1。巴西蘑菇菌丝在不同碳源中的生长速度不同，葡萄糖和玉米粉为碳源时菌丝生长情况明显好于其它碳源，玉米粉培养基中产生的小菌丝球（D＜1 mm）占绝大多数，菌丝球个数最多，可达655个·50 mL－1，菌丝干重和胞外多糖最高，为 0.952 g·50 mL－1和 72.595 mg·50 mL－1。其次是葡萄糖中产生的总菌丝球个数、菌丝干重和胞外多糖含量分别为 578 个·50 mL－1、0.725 g·50 mL－1和61.328 mg·50 mL－1，说明在这些培养基中接种后萌发点多，生长速度快，因此葡萄糖和玉米粉均是巴西蘑菇液体培养的优良碳源。

2.3 不同氮源对巴西蘑菇生物量和胞外多糖的影响

将基础培养基中的氮源分别更换为麸皮、黄豆粉、尿素和硫酸铵，摇床培养7 d，测定生物量和胞外多糖，结果见表2。巴西蘑菇菌丝在以麸皮和硫酸铵为氮源的培养基中菌丝生物量大，胞外多糖含量高，分别为 0.805 g·50 mL－1、89.933 mg·50 mL－1、0.768 g·50 mL－1和 94.825 mg·50 mL－1，说明硫酸铵和麸皮都是巴西蘑菇液体培养的良好氮源。

表1 不同碳源对巴西蘑菇生物量和胞外多糖含量的影响Table 1 Effect of different carbon sources on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

表2 不同氮源和生长因子对巴西蘑菇生物量和胞外多糖产量的影响Table 2 Effect of different carbon sources and growth factors on biomass and exopolysaccharide content of Agaricus blazei

2.4 不同生长因子对菌丝生物量和胞外多糖含量的影响

在基础培养基中分别添加10%的巴西蘑菇菌糠汁和0.5%的酵母粉，摇床培养7 d，测定生物量和胞外多糖，结果见表2。巴西蘑菇菌丝体在添加巴西蘑菇菌糠汁的培养基中生长状况明显好于对照，表现在生物量明显增加，胞外多糖含量显著提高，生物量和胞外多糖分别达1.007 g·50 mL－1和127.734 mg·50 mL－1，可见栽培过巴西蘑菇的菌糠废料是其液体培养时优良的生长促进剂，而酵母粉对菌丝液体培养没有明显促进作用。

2.5 培养基综合试验

根据经验和报道，姬松茸液体培养中采用复合培养基菌丝体生长状况好于简单培养基，综合上述试验结果，选用2%玉米粉和2%葡萄糖作碳源，以1%麸皮和1%硫酸铵作氮源，添加10%的巴西蘑菇菌糠汁，设计综合培养基，摇床培养7 d，测定生物量和胞外多糖，结果见表2。综合培养基的生物量显著增加，直径＜1 mm的菌丝球占绝大多数，总数达1 498个·50 mL－1，菌丝体干重1.226 g·50 mL－1，胞外多糖积累量 189.428 mg·50 mL－1，证实复合碳、氮源更有利于姬松茸菌丝体生长和胞外多糖积累。

2.6 正交试验筛选最佳培养基配方

选择玉米粉＋葡萄糖/麸皮＋硫酸铵、巴西蘑菇菌糠汁及KH2PO4＋MgSO4·7H2O四因素，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验（培养基中均含VB110 mg·50 mL－1），因素水平表见表3。正交试验结果见表4。各因素的最优水平组合是A3B3C2D1，即玉米粉2%、葡萄糖1%、麸皮2%、硫酸铵0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。

表3 试验因子水平Table 3 Level of experimental factor (%)

表4 正交试验结果Table 4 Result of orthogonal experiment

对胞外多糖产量的影响因素进行直观分析，A因素极差R值为246.4，明显大于B、C、D三因素，说明A因素对胞外多糖产量影响最大，即玉米粉和葡萄糖浓度和配比对巴西蘑菇胞外多糖产量起主要作用，各因素的主次顺序为：A＞C＞B＞D。

对正交试验胞外多糖产量进行方差分析，结果见表5。A因素即玉米粉和葡萄糖浓度及配比对胞外多糖产量有极显著的影响，而麸皮和硫酸铵浓度及姬松茸菌糠汁对胞外多糖产生有非常显著的影响，KH2PO4和MgSO4·7H2O则影响不显著。

表5 正交试验胞外多糖产量方差分析结果Table 5 Result of exopolysaccharide output variance analysis in orthogonal experiment

3 讨论与结论

3.1 巴西蘑菇液体发酵的最适培养基

为适合工业生产，试验中采用了价格低、来源广的有机碳、氮源作为材料，对巴西蘑菇液体培养基的配方进行筛选，得到巴西蘑菇液体发酵的最适培养基的配方为玉米粉2%、葡萄糖1%、麸皮2%、硫酸铵 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、巴西蘑菇菌糠汁10%。玉米粉和葡萄糖、麸皮和硫酸铵分别是巴西蘑菇液体培养的优良碳、氮源。玉米粉在食用菌液体培养中的作用在其他报道中已被证实[3]，由于玉米粉溶液粘度较大，增加了培养液的粘性拉力，菌丝间易被发酵液机械性地拉开，从而使菌丝球小型化。在食用菌液体培养液中一般认为应有大量的菌丝球，这样生长中心多，生物量大，而且菌丝球的大小应在1 mm左右，这样菌丝球内部不会产生氧和营养饥饿的情况，使菌丝生长受到抑制[4]。培养基中添加巴西蘑菇菌糠煮汁不仅明显促进了巴西蘑菇菌丝体生长和胞外多糖积累，而且产生了大量的小菌丝球，可能由于巴西蘑菇菌糠中存在有利于巴西蘑菇菌丝生长的多种营养因子。很多报道中使用的酵母粉的效果远不如巴西蘑菇菌糠煮汁。天然原料如玉米粉、麸皮优于葡萄糖、蔗糖、硫酸铵、尿素等简单原料，两种类型的原料配合使用效果更佳。

3.2 巴西蘑菇液体发酵胞外多糖含量的变化

在巴西蘑菇发酵液中，有一定含量的胞外多糖，由于真菌的多糖大部分存在于细胞内部，在一定条件下才有一部分分泌到细胞外。因此，液体培养基中胞外多糖含量与菌丝生物量不成正相关。培养基加入巴西蘑菇菌糠煮汁，不仅对菌丝球生长有利而且有利于胞外多糖的分泌，但菌糠汁中有巴西蘑菇菌丝体的胞内多糖，因此，在测定发酵液中胞外多糖时需减去50 mL 10%的巴西蘑菇菌糠煮汁所含的多糖量。

3.3 巴西蘑菇菌糠对菌丝体生长的促进作用

栽培食用菌后的菌糠的应用价值值得重视，倪新江等认为食用菌栽培结束后，菌糠中的含氮量大幅度升高[5]。不同的食用菌菌糠在其他的食用菌栽培中往往有重要的利用价值。本试验证实了巴西蘑菇菌糠对这种食用菌液体培养菌丝体生长的促进作用，在巴西蘑菇母种培养基中使用的金针菇菌糠对菌丝体生长也有促进作用。

3.4 巴西蘑菇液体发酵菌丝体生长的变化

据报道食用菌液体培养需先静止培养1～2 d[6-8]，试验中也发现，如果不静止培养，则巴西蘑菇菌丝体在液体培养基中萌发较慢。在接种时应注意使接种块的菌丝面向上，漂浮于液体的表面，待菌丝体萌发后再上摇床。在静止培养时，添加巴西蘑菇菌糠的培养基菌种块萌发较快，菌丝浓密，经过48 h，菌丝可长达3 mm，而其他培养基的菌丝一般短而疏[9-10]。

食用菌的深层发酵技术越来越受到人们的重视，因为在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在最适的温度、pH、氧气和C/N等条件下生长，呼吸作用产生的代谢废气能及时排出，新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，在短期内就能获得大量的菌丝体，适合大规模工业生产的要求。发酵液经醇析去蛋白可得到胞外多糖，用菌丝体代替子实体可制备菌丝体多糖，这不仅在医药、保健工业中有很高的应用价值，而且在食品、饲料等工业上也有广阔的前景。

[1] 陈智毅,李清兵,吴娱明,等.巴西蘑菇的食疗价值[J].中国食用菌,2001,20(4):4-6.

[2] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社,1987.

[3] 杨梅,林琳,张其昌.姬松茸菌丝深层培养及氨基酸分析研究[J].中国食用菌,1997,16(3):41-43.

[4] 张甫安,陈国荣,李伟芳,等.菌菇深层发酵和液体菌种生产[J].中国科学文化,2001,45(2):66-69.

[5] 倪新江,梁丽琨,丁立孝,等.姬松茸在两种培养基上生长期间九种胞外酶活性变化[J].菌物系统,2001,20(4):526.

[6] 凌建亚,李灏,张长铠.浓香乳菇深层发酵工艺的研究[J].食品与发酵工业,2000,26(4):3-5.

[7] 李滢冰,冯梦醒,徐继祖.海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多糖的提取[J].食品与发酵工业,2000,26(2):11-15.

[8]杨淑云.巴西蘑菇液体发酵菌丝体与子实体蛋白质的营养评价[J].福建农业学报,2009,24(1):82-84.

[9] 殷蓓蓓,周晓燕,李爽.姬松茸的研究与进展[J].工业微生物,2007,37(2):52-56.

[10]张硕,李明,李守勉,等.猴头菌菌丝体与子实体多糖产量相关性分析[J].安徽农业科学,2009,37(15):6946-6947.