复方中草药对镜鲤（Cyprinus carpio L.）血清转氨酶及红细胞抗氧化酶活性的影响

孟兆娜，陈玉春，管雪婷，张 辉，刘 敏*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

随着水产养殖业集约化程度的不断提高，大量化学及抗生素类药物被长期使用，不但造成环境和水质污染，而且致使病原体的抗药性和水产品的药残、药害等毒副作用日益增强，给水产养殖业造成了严重的经济损失。中草药具有成本低、加工方便、抗药性小且药物残留少、效果显著等特点，已逐步成为水产动物饲料添加剂研究的热点[1]。其中，部分中草药成分已作为免疫增强剂得到广泛应用，同时还是良好的抗菌、抗病毒的治疗药物[2]。研究表明，中草药可以有效提高淡水虾、中国对虾、异育银鲫和牙鲆的免疫力[3－7]。蔡中华等研究报道，黄连、大黄及花粉对鲤鱼的非特异性免疫功能具有增强作用[8]。陈玉春等研究了中草药作为饲料添加剂对鲤鱼血清转氨酶的影响，发现对鲤血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性有一定的降低诱导作用[9]。蔡春芳等研究发现，大蒜、螺旋藻、刺五加、黄芪能够显著促进银鲫血清中溶菌酶、超氧化物岐化酶的活性[10]。

目前，复方中草药作为免疫调节剂对镜鲤免疫学的研究在国内鲜有报道，本试验通过金银花、刺五加、枸杞子、黄芪配伍的四组复方中草药研究对镜鲤血清转氨酶及红细胞中过氧化氢酶、超氧化物岐化酶活性的影响，为复方中草药作为鱼类免疫增强剂的应用研究提供一定的理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

金银花、刺五加、枸杞子、黄芪（均购自哈尔滨市宝丰药店），经烘干、粉碎后按一定比例进行组方，制成四种复方（复方Ⅰ、复方Ⅱ、复方Ⅲ、复方Ⅳ）。基础日粮以国产鱼粉17%、豆粕47%、麸皮23%、面粉10%、食盐0.6%、磷酸二氢钙1.2%、预混料1.2%为原料进行配制。每复方称取原料20 g，置于砂锅中并加入200 mL蒸馏水，煎煮3次，每次30 min，合并3次滤液添加到1 kg的基础日粮中并混匀，制成含2%复方水提液的药物饲料结果见表1。

表1 复方中草药配方比例Table 1 Formula proportional of Chinese herb compounds (%)

1.2 试验动物

试验用镜鲤（Cyprinus carpio L.）购自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所松浦实验站。试验前，投喂不含中药添加剂的饲料（基础日粮）对实验鱼进行驯化，使其逐渐适应实验饲料。经过14 d的驯化饲养后，选择体型均匀、初始体重为（160±15）g的实验鱼，将实验鱼分为5个处理，每个处理2个重复，每个重复18尾，试验周期为42 d。各处理组依次为对照组（基础日粮组）、复方Ⅰ、复方Ⅱ、复方Ⅲ、复方Ⅳ。实验鱼饲养于室内玻璃水族箱（0.9 m×0.5 m×0.5 m），体积为 180 L。以充分曝气的自来水作为循环水源。水温控制在23±1 ℃，pH 7.6～8.0。溶解氧＞8 mg·L－1。日投喂量为鱼体重的1.5%，早、中、晚各投喂（分别为8:30、12:30、17:00）1次，3 d换水1次，6 d消毒1次。

1.3 样品收集与测定

试验过程中，分别于14、28、42 d从各试验组中随机取3尾鱼于尾静脉取血4.5 mL，将其中0.5 mL血液经肝素钠抗凝备用；剩余4 mL血液静置 2 h，以 1 000 r·min－1离心 10 min，得到血清样品，置－20℃冰箱保存备用。

取50 μL抗凝血加双蒸水至2.5 mL混匀配成1：49的溶血液，进行红细胞CAT活性的测定；取抗凝血 50 μL，加入2 mL生理盐水，以 2 000 r·min－1转速离心3 min，去上清并加入冰双蒸水0.2 mL混匀，随后加入95%乙醇0.1 mL振荡30 s，并加入三氯甲烷0.1 mL置旋涡混匀器混匀1 min，以3 500 r·min－1离心8 min，吸取上清液并记录其体积，进行红细胞SOD活性的测定。

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定血清中GOT、GPT的活性及红细胞中CAT、SOD的活性。

1.4 数据分析

采用SPSS 13.0对所得数据进行单因素方差分析（One－way ANOVA），若有显著差异，再作LSD多重比较，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 血清GOT、GPT活性的变化

四种复方中草药对镜鲤血清GOT、GPT活性的影响见表2。

表2 镜鲤血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

表2 镜鲤血清GOT、GPT活性（±S）Table 2 GOT and GPT activities in serum of Cyprinus carpio L.(±S)

注：同列相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05），不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），同列不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01），未标注差异不极显著。下表同。Notes:values in the same column with the same little letters are no significant difference(P＞0.05),with different little letters are significantly differentce(P＜0.05),values in the same column with different capital letters are extremely significant difference(P＜0.01).The same as below.

时间（d）Time组别Group谷丙转氨酶（IU·L－1）Glutamic－pyruvic transaminase 24.38±9.20 22.96±5.37 14谷草转氨酶（IU·L－1）Glutamic－oxal(o)acetic transaminase 44.58±8.77 41.55±11.63 37.37±6.5520.46±8.86 40.15±10.19 25.60±7.28 39.63±5.22 23.70±8.20 43.86±12.32b 19.35±4.82b 38.22±8.48ab 18.47±6.41ab 2833.30±5.01a 14.35±2.74ab 37.06±7.21ab 13.54±2.67a 42.64±12.77b 15.63±3.94ab 40.73±11.88 20.62±2.14Bc 37.78±13.31 12.14±5.08Aab 42对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ32.49±4.87 7.62±1.85Aa 36.77±7.73 14.13±9.21Ab 36.80±8.5413.89±6.73Ab

从表2可以看出，14 d时，血清GOT活性各复方组与对照组差异不显著（P＞0.05）；28 d时，复方Ⅱ组与对照组差异显著（P＜0.05），复方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组与对照组差异不显著（P＞0.05）；42 d时，各复方组与对照组差异不显著（P＞0.05）。14 d时，血清GPT活性各复方组与对照组差异不显著（P＞0.05）；28 d时，仅复方Ⅲ组与对照组差异显著（P＜0.05），复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组与对照组差异不显著（P＞0.05）；42 d时，各复方组与对照组差异极显著（P＜0.01），但各复方组之间差异不显著（P＞0.05）。试验周期内4个复方组均有效地降低了血清中GOT及GPT的活性，且随中草药饲喂时间的增加，GOT及GPT的下降幅度也随之增加，GPT活性的下降幅度比GOT大，表明4组复方在该试验周期内对鱼体肝脏起到了一定程度的保护作用。

2.2 红细胞CAT、SOD活性的变化

四种复方中草药对镜鲤红细胞CAT、SOD活性的影响见表3。从表3可以看出，14 d时，各复方组红细胞CAT活性与对照组差异不显著（P＞0.05）；28 d时，仅复方Ⅰ组与对照组差异显著（P＜0.05），虽然其他复方组与对照组差异不显著（P＞0.05），但是其红细胞CAT活性明显高于对照组，说明此期间各复方诱导CAT活性升高。42 d时，仅复方Ⅰ组与对照组差异显著（P＜0.05），但是各复方组CAT活性均呈现下降的趋势。14 d时，红细胞SOD活性各复方组与对照组差异不显著（P＞0.05）；28 d时各复方组与对照组差异极显著（P＜0.01），各复方组SOD酶活性均保持在较高水平；42 d时，各复方组与对照组差异不显著（P＞0.05），虽然开始呈下降趋势，但仍明显高于对照组。

表3 镜鲤红细胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

表3 镜鲤红细胞CAT、SOD活性（S）Table 3 CAT and SOD activities in erythrocyte of Cyprinus carpio L(±S)

时间（d）Time组别Group对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ对照复方Ⅰ复方Ⅱ复方Ⅲ复方Ⅳ过氧化氢酶（U·g－1Hb）Catalase 32.71±4.57 40.10±11.91超氧化物歧化酶（U·g－1Hb）Superoxide dismutase 386.52±102.35 487.96±304.36 1437.18±8.14461.56±119.07 37.28±10.67 497.25±215.42 35.42±8.06 559.41±279.01 33.51±6.65a 528.79±92.27Aa 43.42±10.80b 1 326.41±324.01Bc 2838.52±9.27ab 936.17±227.47Bb 39.90±11.48ab 1 155.20±427.64Bbc 35.63±6.83ab 1 023.45±153.15Bb 30.00±4.70a 335.12±160.86 39.58±7.23b 514.46±207.46 4233.17±11.28ab 436.33±168.33 35.37±6.72ab 410.19±171.59 32.82±9.51ab 373.10±304.68

3 讨论与结论

3.1 复方中草药对血清转氨酶活性的影响

GPT和GOT是广泛存在于动物线粒体中的重要的氨基酸转氨酶，在机体蛋白质代谢中起重要作用[11]，其活性变化亦是反映肝细胞受损伤的主要敏感指标。在正常情况下，血清中正常转氨酶活性值较小；当组织中毒发生病变或者受损伤的组织范围较大，可引起血清中GPT和GOT浓度上升或活性突然持续性增强[12]。血清转氨酶升高反映肝细胞受损，其增高程度大致与病变严重程度相平行[13]。因此血清中GOT和GPT活性的增减可以反映机体中毒或病理变化。陈鹏飞等通过两种中草药组方对鲫鱼转氨酶影响研究发现中草药对鱼体有保肝的功效[14]，即可以有效地的使血清中的GOT、GPT降低，且随添加浓度的升高，鱼体血清中GPT和GOT的下降幅度也随之增大。田海军、杨加琼等同样得出类似结论[15－16]。在本试验中，14 d时仅复方Ⅰ肝脏GOT活性与对照组差异显著（P＜0.05），其余各复方组肝脏GOT、GPT活性与对照组差异均不显著（P＞0.05）；28 d时，复方Ⅱ组血清GOT活性和复方Ⅲ组血清GPT活性极显著与对照组差异显著（P＜0.05）；42 d时，各复方组血清GPT活性与对照组差异极显著（P＜0.01）。随中草药饲喂时间的增加，GOT、GPT活性下降幅度也随之增大。结果表明，本试验4组复方在42 d内未对肝脏造成损伤，还在一定程度上起了保护作用，其中复方Ⅰ组转氨酶活性值降低幅度最小。

3.2 复方中草药对红细胞CAT活性的影响

过氧化氢酶（CAT）又称触酶，是生物体内重要的抗氧化防御性功能酶，体内SOD清除过量O2－所产生的过量H2O2可由CAT与谷胱甘肽过氧化物酶等一起消除，从而维持机体正常的机能[17－18]。CAT酶广泛存在于鱼体的各个器官中，是评价污染物对水生生物影响的重要指标[19]。大量试验表明，在污染胁迫下生物体可通过增强CAT清除活性氧的水平以减轻对机体的伤害，其活性可因氧化污染的胁迫而发生改变[20－22]，因此CAT的活力变化在一定程度上能反映出机体在胁迫环境下的抗氧化系统的变化。试验表明，14 d时复方Ⅰ诱导CAT的活性使其升高，降低了中草药对组织细胞氧化损伤作用，有效的防御组织的过氧化损伤，随着试验时间的延长这种作用表现为降低。28 d时，虽然仅复方Ⅰ组红细胞CAT活性与对照组差异显著（P＜0.05），但其余各复方也均诱导CAT活性升高；42 d时，复方Ⅰ与对照组差异极显著（P＜0.01），但各组CAT活性均呈现下降趋势。试验初期，机体为清除过多的H2O2，通过自身调节而使CAT的合成量升高，但随着试验时间的延长，机体产生了大量的活性氧中间体，超过了机体清除活性氧的能力，使大量活性氧中间体作用于酶蛋白分子的关键性氨基酸残基，使CAT上的－SH巯基氧化成SOS，从而改变CAT酶的结构，使CAT活性降低[23]，对机体抗氧化系统产生了不同程度的伤害。由表3可得，复方Ⅰ组中CAT值升高最明显，红细胞CAT活性受复方Ⅰ的影响最大。

3.3 复方中草药对红细胞SOD活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是反映机体非特异性免疫功能的重要生理指标。它是一种碱性蛋白，能水解革兰氏阳性细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解后被释放出来，形成一个水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物。其活性变化可反映机体清除自由基的能力，对于增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能具有重要作用[24]，因而SOD经常被用作环境胁迫与水域污染的潜在指标。SOD是清除活性氧免受细胞氧化伤害的主要抗氧化酶类之一，在防御机体衰老和生物分子损伤等方面有极为重要的作用[18]，它催化超氧阴离子自由基O2－发生歧化反应，从而清除O2－，减少超氧阴离子在生物体内的积聚并阻断其转化为自由基，维持细胞内的氧自由基处于低量无害状态[25－26]。直至1969年McCord和Fridovich研究了该蛋白的活性以后[27]，才根据其酶活特性定名为超氧化物歧化酶。本试验表明：14 d时，各复方组与对照组差异均不显著（P＞0.05）；28 d时，各复方组与对照组差异极显著（P＜0.01），各复方组SOD活性均保持在较高水平，虽然在第42天开始呈下降趋势，但仍明显高于对照组。证明本试验的四个复方对镜鲤红细胞的SOD活性有一定的诱导作用，并且复方Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ组SOD活性均表现为“先增高再降低”，复方Ⅱ组的SOD活性随着作用时间的增加也逐渐被诱导增高。原因可能是各复方在处理初期对红细胞SOD活性有诱导作用，这种诱导作用是由活性氧自由基的增加所引起的机体代偿性增多所致。这和樊甄姣报道的氨氮浓度引起SOD活性暂时升高相一致。随着药物作用的时间延长[28]，鱼体内O2－对羟胺的氧化反应被抑制，使O2－含量升高，消耗大量的SOD，导致SOD水平的降低。机体在清除大量自由基的过程中，ATP生成减少，细胞内能量不足，使SOD合成发生障碍、活性下降，使机体清除自由基的能力下降[29]，堆积的自由基一方面可直接作用于细胞，产生细胞结构和功能的损害，另一方面可致微循环发生变化，使细胞缺血缺氧，产生代谢障碍，进一步加剧机体损害[30]，从而导致鱼体的免疫能力、抗应激能力和抗病能力的下降。SOD作为抗氧化剂的作用随着药物作用时间延长而逐渐减弱，从而造成鱼体的过氧化胁迫，进而有产生毒性作用的趋势，建议用药时间为28 d。

本试验得出，本复方中草药可以按质量分数为2%的量加到镜鲤饲料中，以增强其血清转氨酶及红细胞抗氧化酶的活性，进而增强其抗病力，其中复方Ⅰ效果最佳，建议用药时间为28 d。

[1] 吴梅秀.中草药及其在水产养殖中的应用[J].畜牧兽医杂志.2008,27(2):64－65.

[2]谢仲权,牛淑琦.天然植物饲料添加剂生产技术与质量标准[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005:23－28.

[3] 陈孝煊,吴志新,张厚梅.大黄与黄连对二种淡水虾血细胞吞噬活性的影响[J].水生生物学报,2002,26(2):201-204.

[4] 罗日祥.中草药制剂对中国对虾免疫活性物的诱导作用[J].海洋与湖沼,1997,28(6):573-576.

[5] 杜爱芳,叶均安,于涟.复方大蒜油添加剂对中国对虾免疫机能的增强作用[J].浙江农业大学学报,1997,23(3):317-320.

[6] 陈孝煊,吴志新,殷居易,等.大黄、穿心莲、板蓝根和金银花对异育银鲫免疫机能的影响[J].中国水产科学,2003,10(1):36-39.

[7] 王吉桥,孙永新,张剑诚.金银花等复方中草药对牙鲆生长、消化和免疫能力的影响[J].水产学报,2006,30(1):90-96.

[8] 蔡中华.4种中草药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响[J].天津农学院学报,1998,5(2):31-32.

[9]陈玉春,顾雪飞,刘敏.5种中草药对鲤血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及红细胞过氧化氢酶活性的影响[J].淡水养殖,2007,9(5):11-13.

[10]蔡春芳,宋学宏,潘兴法,等.几种抗病促生长剂对银鲫生长和免疫力的影响[J].水利渔业,2002,22(2):20-22.

[11]王媛,杨康健,吴中,等.氯氰菊酯对鲫鱼血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶活力的影响[J].水产科学,2005,24(9):8-10.

[12]郑永华,蒲富永.汞对鲤鲫鱼组织转氨酶活性的影响[J].西南农业大学报,1997,19(1):41-45.

[13]邓毅,宁艳梅.甘草甘遂配伍对小鼠血清GPT、GOT、LDH影响的实验研究[J].实验研究,2007,3(20):15-16.

[14]陈鹏飞,杨德强,邹红,等.两种中草药组方对鲫鱼肝脏转氨酶的影响[J].水产养殖,2005,26(6):28-31.

[15]田海军,陈建国,龙勇,等.复方中草药对鲤肝脏转氨酶的影响[J].水产学报,2007,26(11):625-627.

[16]杨加琼,陈鹏飞,杨德强,等.中草药组方对鲫鱼肝脏转氨酶的影响研究[J].试验研究,2006,208:14-16.

[17]Lledyas F,Rangel P.Oxidation of eatalase by singletoxygenn[J].J Bilo Chem,1998,273:10630-10637.

[18]谢巧雄,朱心玲.亚硒酸钠对四氯化碳损伤草鱼肝原代细胞与肝组织的保护作用[J].水生生物学报,1996,20(3):229-235.

[19]许黎黎,邵雪玲.鲫鱼不同组织过氧化氢酶同工酶活性的比较[J].氨基酸和生物资源,2003,25(4):69-70.

[20]Rgeot T,Bocquene G,Dorte C,et al.Bioindications of pollutant exposure in the western Mediterranean Sea[J].Ar Ecol Prog Ser,1996,131:125-141.

[21]Cossu C,Doyotte A,Jacquin M C,et al.Glutathione eductase,selenium dependent gltathione peroxidase,glutathione levels and lipid peroxidation in fresh water bivalves,Unio tumidus,as biomarkers of aquatic contamination in field studies[J].Ecotox Environ Safe,1997,38:122-131.

[22]Livingstone D R,Archibalds,Chipman J K,et al.Antioxidant enzymes in liver of dab Limanda limanda from the North Sea[J].Mar Ecol Prog Ser,1992,91:97-104.

[23]游学军,郑永华.对氯硝基苯对草鱼种肝胰脏过氧化氢酶活性的影响[J].西南农业学报,2001,14(4):79-82.

[24]牟海津,江晓路,刘树青,等.免疫多糖对栉孔扇贝酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J].青岛海洋大学学报,1999,29(3):463-468.

[25]Roche H,Boge G.Fish blood parameters as a potential tool for identification of stress caused by environmental factors and chemical intoxicat[J].Marine Environmental Research,1996,41(1):27-43.

[26]Achuba F I.Superoxide dismutase and lipid peroxidation levels in fish from the ethiope river in Southern Nigeria Bull[J].Environ ContamToxicol.2002,69:892-899.

[27]McCordJM,FridovichI.Superoxidedismutase.anenzymicfunc－tion for erythrocuprei-n(hemocuprein)[J].J Biol Chem,1969,244(22):6049-55.

[28]樊甄姣,刘志鸿,杨爱国.氨氮对栉孔扇贝血淋巴活性氧含量和抗氧化酶活性的影响[J].海洋水产研究,2005,26(1):23-27.

[29]茅国有,陈小静.精浆SOD含量测定及临床意义[J].同位素,1996(7):71-72.

[30]刘月辉.突发性聋LPO，SOD测定及甲襞微循环观察[J].耳鼻咽喉一头颈外科,1996,3(4):199-202.