混合菌群糖化纤维素的影响因素研究

贺月林，郭照辉，谭周进

（1.湖南省微生物研究所，湖南 长沙 410128；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

纤维素是植物组织的基本成分，也是绿色植物光合作用的主要产物，它的含量约占植物总量的一半，是地球上既丰富又不断再生的有机物质[1]。随着人们的生活水平的提高，纤维素类物质开始广泛的应用，以纤维素类物质为主的有机废弃物也就日益增多。因此，纤维素分解的研究对减轻废弃物给环境的压力以及纤维素资源的开发和利用有重要的意义。目前，对纤维素的降解利用主要采用生物手段，即利用纤维素分解菌或其产生的酶来降解纤维素[2]，因此，分离和筛选纤维素分解菌的工作尤为重要。产纤维素酶的微生物包括真菌、细菌和放线菌。其中主要有：康氏木霉（Trichoder-makoningii）、黑曲霉（Aspergillusniger）、斜卧青霉（Penicillium decumbens）、芽孢杆菌（Bacillussp.）等，而分解纤维素的细菌又包括好氧性细菌和厌氧性细菌。在还田秸秆的生物腐熟剂中，好氧性细菌制剂的施用可能会导致土壤还原性有害物质产生，对环境和作物都产生不利的影响；而厌氧性细菌制剂的施用，则可能会避免由此而产生的有害影响[3]。笔者在研究了国内外的研究动态之后，从不同生态环境下的土壤中选育出分解滤纸效果较好的好氧性纤维素分解菌与厌氧性纤维素分解菌，试图利用厌氧性细菌与好氧性细菌一起制成秸秆腐熟剂，充分利用好氧性细菌繁殖快和厌氧性细菌耗氧低或不耗氧的特点。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试材料 供试材料为湖南省微生物研究所附近不同生态环境下有机质含量较高的土壤，分别采自畜牧场、淤水沟、大田、鱼塘、菜地等地方，共40份采样。

1.1.2 培养基 （1）好氧性纤维素分解菌（改良查氏培养基）[4]：NaNO31 g， (NH4)2SO41 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，CMC-Na 1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.4，琼脂20 g；（2）厌氧性纤维素分解菌培养基[4]：KNO31 g，NH4H2PO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·6H2O 0.3 g，CaCO35 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蛋白胨1 g，H2O 1 000mL，无淀粉滤纸条。

1.2 方 法

1.2.1 纤维素分解菌的分离培养 （1）好氧性纤维素分解菌:采用稀释平板分离法[4]，将改良查氏培养基倒入培养皿，摇匀，置桌面冷凝成平板，取不同土样放入无菌水中，摇匀，制成土壤稀释液。将土壤稀释液上清液0.1mL滴入平板中，用无菌涂棒使其分布均匀，在37℃下培养2～3 d，将纤维素分解菌进一步纯化在斜面上保存。（2）厌氧性纤维素分解菌:用带无淀粉滤纸条的厌氧性纤维素分解菌培养基培养。滤纸剪成4 cm×1 cm的长条状，厌氧性纤维素分解菌培养基15mL装入30mL的大试管中，将1 g土样和滤纸条装入试管，用棉花塞封口，37℃培养7～14 d，将滤纸条溶解的样品进一步富集，保存。

1.2.2 摇床培养 （1）挑选保存的好氧性纤维素分解菌2环到装有100 mL改良查氏液体培养基的300mL三角瓶中，摇床转速150 r/min，37℃培养36 h。（2）取保存的厌氧性纤维素分解菌5 mL到装有厌氧性纤维素分解菌培养基500mL的密封盐水瓶中，保持其较好的气密性，摇床转速120 r/min，37℃摇床培养48 h。

1.2.3 酶活力测定 用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活[5]。取摇床培养后生成的酶液10 mL，2 000 r/min离心5 min，取上清液0.2 mL与CMC-Na 1.8 mL混合，在50℃下恒温水浴30min，以沸水中加热5 min灭活酶液做对照，还原糖用3,5-二硝基水杨酸法测定。以每毫升酶液在30min所产生的葡萄糖毫克数定义为一个酶活单位。

1.2.4 底物对纤维素酶活性的影响 将有纤维素酶活性的好氧性纤维素分解菌与厌氧性纤维素分解菌同时分别接种在含CMC-Na、稻草粉和滤纸的改良查氏培养基中，摇床培养，测定酶活，进行比较。

1.2.5 尿素对纤维素酶活性的影响 将有酶活性的好氧性纤维素分解菌与厌氧性纤维素分解菌同时接种在以尿素做N源的改良查氏培养基中，并改变其用量，摇床培养，测定酶活，进行比较。

1.2.6 磷酸盐的用量对纤维素酶活性的影响 将有酶活性的好氧性纤维素分解菌与厌氧性纤维素分解菌同时接种在不同P源用量的改良查氏培养基中，摇床培养，测定酶活，进行比较。

2 结果与分析

2.1 纤维素分解菌的培养特征

好氧性纤维素分解菌在37℃下培养2～3 d后，平板上出现乳白色粘液，透明圈边缘整齐，直径约1.0～5.0mm，最后出现黄色圆斑，将细菌纯化，挑选单菌落斜面保存，得到20种不同土壤来源的菌株；厌氧性纤维素分解菌在37℃下培养7～14 d后，试管中滤纸软化，表面成絮状，最后断裂、完全崩解，保存有上述特征的土壤样品液。

2.2 纤维素分解菌产酶活性的测定

经过初步筛选，得到20种土壤产生的纤维素分解菌，将这些菌种保存，进行摇床培养，测定酶活，得到7种酶活较高的好氧性纤维素分解菌和6种厌氧性纤维素分解菌，7种好氧性纤维素分解菌A 至 G 产酶活性分别为 54.27、37.00、40.50、47.40、63.20、42.40、26.97 U/mL，6 种厌氧性纤维素分解菌a 至 f产酶活性分别为 93.02、48.24、72.35、77.52、68.91、79.24 U/mL。

2.3 好氧性纤维素分解菌与厌氧性纤维素分解菌之间产酶的影响

鉴于好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌产酶时的相互影响，将纤维素酶活性较强的厌氧性纤维素分解菌a与好氧性纤维素分解菌A按1.2.2中（2）的摇床方法进行摇床培养，测得酶活为79.24 U/mL。此结果说明了厌氧性纤维素分解菌与好氧性纤维素分解菌在产酶时没有受到相互抑制。

2.4 底物对纤维素酶活性的影响

用菌株A与菌液a混合培养测定以稻草粉为底物产生的酶活为41.3 U/mL，以CMC-Na为底物产生的酶活为54.3 U/mL，以滤纸为底物产生的酶活为20.6 U/mL，经比较不同底物对纤维素酶活性的影响，得到以CMC-Na为底物产生的酶活最大，稻草粉次之，滤纸最小。

2.5 尿素对纤维素酶活性的影响

用菌株A与菌液a混合培养测定在不同尿素含量下的酶活。当N源用量为0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%时，菌株产生的纤维素酶活分别为41.34、34.45、22.40、17.24、10.33 U/m L。这说明使用0.1%尿素做N源时所产生的纤维素酶活性最高，此后随着N的含量的不断增加，酶活性减小。

2.6 磷酸盐对纤维素酶活性的影响

用菌株A与菌液a混合培养测定在不同磷酸盐含量下的纤维素酶活。当磷酸盐用量为0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%时，菌株产生的纤维素酶活分别为 28.5、33.5、44.8、59.2、61.4 U/m L。这表明随着磷酸盐的含量不断增加，酶活性有增加的趋势；但其含量从0.2%增加到0.5%时，纤维素酶的活力增加不大。

3 讨 论

目前，国内推行将秸秆直接还田。在配合秸秆还田的制剂方面，日本的酵素菌、EM，国内的腐秆灵，其腐熟效果都不佳，特别是在腐解速度上。同时，国内外研究者为了加快腐解速度，研制了一些促进微生物生长的产品，虽然取得了一定的效果，但是还田秸秆在快速腐解的过程中，产生了大量的还原物质，对作物有较大的毒害作用，影响作物的生长，还加大了还原性有害气体的产生，如甲烷、NO、N2O等，造成温室效应。这是由于目前国内使用的微生物主要为好氧性的，在分解秸秆的过程中，要消耗大量的氧气。日本已经生产了一种厌氧性微生物制剂，既可以促进秸秆的较快腐解，又可以减少对作物的损害。应用资料显示，该制剂能够促进秸秆腐熟，提高作物抗逆与抗病虫害的能力，使作物早生早发、耐倒伏，改善土壤结构等等。因此，从事厌氧性纤维素分解微生物制剂的研发，在理论上和实践中都是可行的。本研究筛选到一种能够在好氧性与厌氧性条件下共同使用的纤维素腐解制剂生产组合菌，并且对纤维素分解菌的产酶条件进行了初步研究，为相关制剂的研制与应用奠定了基础。其中的好氧性纤维素分解菌能够快速分解纤维素，造成局部厌氧性环境，促进厌氧性纤维素分解细菌的作用，减少还原性有害物质的生成。有关该制剂的进一步研究与应用还有待于深入进行。

[1] 张秀红，张彩琴，张如云，等.高活性纤维素分解菌株的筛选及其产酶条件的研究[J].山西师范大学学报，2002，16（3）：56-60.

[2] 许修宏，肖玉珍，李 杰.高效纤维素分解菌筛选的研究[J].东北农业大学学报，1998，29（4）:23-24.

[3] 谭周进.稻草还田与环保[J].湖南农业，2003，（5）：16.

[4] 李阜棣，喻子牛，何绍江.农业微生物实验技术[M].北京：中国农业出版社，1996.

[5] 北京大学生物系生物化学教研室.生物化学实验指导 [M].北京：人民教育出版社，1980.22-24.