哺乳动物的精子获能及其鉴定

张士芳

（1.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省科学院自然与生态研究所 150040）

人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精，它必须经历一系列生理、生化及形态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为获能（capacitation）[1]。精子获能是精子受精前必须经历的一个生理阶段。自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部[2]。研究表明，精子获能不仅可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当的培养条件下进行。

1 精子获能的方法

精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。

1.1 体内获能

早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制[3]。进一步研究发现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进行获能。将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养同样能使精子获能[4]。精子在成熟过程中，表面被覆了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有抑制作用。在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运动时，子宫颈黏液、输卵管液和卵泡液，以及输卵管上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促进获能的发生。由于体内获能的研究，经常受到许多条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内，特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获能的因子，对于复杂的体内环境人们又很难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难。为此，体外获能的研究方法应运而生[3]。

1.2 体外获能

早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体液（如输卵管液、滤泡液和血清等），而这些体液的成分相对复杂，很难确定何种成分诱发或支持精子获能。自从Toyoda等最先报道了采用一种特定的化学培养基获得体外受精成功以来，分析体外精子获能已成为比较容易的事情[5]。以Tyrode、KRB、HamF10、BSA、BWW、BO等培养液进行哺乳动物精子获能培养均见报道。目前，常用的为BO液和改良的Tyrdoe液（TALP）两大类。许多哺乳动物，如鼠、牛、猴、马等，其精子体外获能的研究越来越多。近年来的研究表明，体外获能发展起来的实验手段几乎可以达到与体内获能相同的效果，这就使得体外获能的研究可以揭示体内获能的本质[6]。精子体外获能技术可以较好地控制实验条件，并可逐个分析获能的相关因子，极大地促进了精子获能的研究。

精子体外获能总体包括两个步骤：一是精液的处理，目的是减少或去除精浆内前列腺素、免疫活性细胞、细菌和碎片，减少精液的黏稠度，以促进精子获能；二是使用某些特定成分诱导精子获能和顶体反应[3]。目前，诱导精子体外获能的方法主要有上浮法、沉淀加上游法和不连续密度梯度法。

经上浮法处理可获得活力较强的精子，但精子回收率较低，目前该方法已成为牛精子（尤其是冻精）洗涤与体外获能的主要方法；精子沉淀加上游法适用于精子活力尚可或含有大量白细胞及碎片的精液，此方法有利于分离活动精子与死精子，且回收率较高；不连续密度梯度法是近年用于分离精子的良好方法，密度梯度离心法原理是形态正常精子的密度要高于异常的精子，经平衡离心后得到高受精力的正常精子，该法适用于精子数量正常而活力较差的精液。若与精子上浮技术相结合，不连续密度梯度法可获得更高质量的精子[6]。

精子的质量不同，获能所使用的处理方法也不同，要根据精子的来源及质量选择相应的处理方法。江峰根据所使用人精液的质量，将其处理方法分为7种：（l）少精子症，离心后再重悬于较小体积营养液中；（2）弱精子症，离心-上游技术结合添加咖啡因或血管舒缓素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白或牛宫颈黏液滤过、Percoll密度梯度离心；（4）液化不全，玻璃纤维过滤；（5）黏度过高，淀粉酶处理、密度梯度离心等；（6）杂质过多，上游法和Percoll密度梯度离心；（7）逆行射精，洗涤加上游处理[7]。

2 获能评价的方法

精子获能是一系列的生理生化反应过程，其步骤分为：（1）超激活运动 （hyperactivated motility，HAM）：精子鞭毛运动的频率及类型发生改变；（2）获能：精子膜结构及特征的精细改变；（3）顶体反应（Arcosomal reaction，AR）：标志着精子获能已经完成。根据获能精子在运动、形态及代谢等方面的变化特征，创立了多种精子获能的评价方法。目前，常用的精子获能评价方法为精子超激活运动、顶体反应和精子穿卵试验（sperm penetration test，SPA）。此外还有去能因子鉴定法、测定精子呼吸能等方法。

2.1 超激活运动

精子一旦获能，其运动类型即发生显著改变，精子头部侧摆幅度和频率明显增加，尾部振幅加大，频率加快，呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动。它是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类型，所反映的是精子运动能力和方式的改变。其特点是头部运行轨迹呈不规律的“8”字形，并显著地偏离直线。精子的超激活运动一般存在两种运动类型：急剧地前向运动（或穿梭运动）和鞭打样运动[3]。Yanagimachi于1970年首先在仓鼠精子获能时观察到这种现象。Wang等报道，人精子超激活运动的发生率与体外受精率呈高度相关性，并且对于精子穿越输卵管峡部，克服输卵管上皮细胞的阻力，最后穿过卵丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用[8]。

目前，观察精子超激活运动的应用技术有：显微录像技术、连续分步曝光技术和计算机辅助精子分析（CASA）技术等。CASA分析系统在临床研究时备受青睐，它可达到客观准确地量化精子运动情况，通过对精子头部运动轨迹摆动图形的分析，可获得精子运动的多项参数，使人们对精子运动有更深层次的了解[9]。

2.2 顶体反应

顶体反应是精子在获能过程中的生理变化和形态学变化，是哺乳动物的精子具备受精能力的必要条件。早期的研究者认为，顶体反应是由精子质膜和顶体外膜相互融合，形成囊泡化，使顶体内含物逸出顶体。陈大元等认为质膜并不参与顶体囊泡化，而是双层顶体外膜多位点自我融合而成[10]。虽然顶体反应是获能的终点，但获能过程本身还存在着不同阶段，需要采用相应的判断指标。随着细胞生物学、分子生物学和免疫学以及显微镜技术的发展，许多检测精子顶体反应的技术相继建立，如普通光镜中的三色染色法（TST）和考马斯亮蓝染色法（CBB），电子显微镜检查法（TEM）、荧光显微技术中的金霉素荧光染色法（Chlortetracycline，CTC）、Hoechst33258 结合的植物凝集素标记法、顶体酶释放测定法、单克隆抗体间接免疫荧光法和豌豆凝集素（FITC-PSA）标记法等[11]。

近年来，金霉素荧光染色法技术越来越受到人们的重视，它是根据精子不同获能状态进行染色，并可将精子分为3种CTC荧光染色类型，即F、B和AR型。“F”型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光；“B”型精子为已获能精子，其特点是顶体帽仍然存在，但在顶体后区出现一条暗淡的荧光区带；“AR”型精子，顶体帽缺，如整个精子头部显示淡绿色或无荧光，即为完成顶体反应的精子。目前此法已广泛应用在小鼠、牛、猪、猴和狗等哺乳动物和人顶体反应机理研究中。并且Hewitt等将金霉素与活体荧光染料H33258对活精子进行双色染色用于观察整个体外受精获能和顶体反应过程中顶体的变化[12]。

2.3 精子穿卵试验

精子穿卵实验是临床上应用最广泛的评价精子受精能力的重要方法。它不仅可提供精子获能和顶体反应的状况，而且还可以了解精子与卵膜的融合和精核的解聚能力。精子穿卵试验最早由Yanagimachi等报道[13]，后经过简化、改良，并进一步标准化，使之适合于临床应用[14，15]。穿卵试验分为异种穿卵试验和同种穿卵试验。异种穿卵试验主要利用仓鼠卵子和金黄地鼠卵子进行精子获能鉴定。仓鼠卵异种精子体外穿透试验，通过检测经各种方法处理后的复苏冻精或鲜精精子的穿卵率，来评价精子的受精能力和体外获能效果。而去除透明带的金黄地鼠卵子对获能精子没有种间特异性，即能够接受同种或异种动物获能精子的穿入。将去除透明带的金黄地鼠卵子与经过获能处理的精子一起孵育一段时间后，以有膨大的精子头部或有雌雄原核并有精子尾部判断为获能精子穿入[15]。它为筛选避孕药物和评价避孕药物的效果及作用提供了新的方法。精子异种穿卵法在人、鼠、牛等动物精子受精能力的检测中均取得了比较好的效果[16]。

2.4 其他方法

去能因子鉴定法和测定精子呼吸能法也是精子获能的鉴定方法。

去能因子鉴定法是用T-HCl（Tetracycline）标记去能因子，获能处理后，在显微镜下观察，如果没有荧光说明精子表面的去能因子已被除去，精子可能已获能；如果还可以看见荧光，则精子还没有获能。由于荧光的易淬灭性，使得这一方法并不可靠。

测定精子呼吸能法所依据的原理是获能精子比新鲜精子代谢能量要大。但是由于其操作繁琐，结果不稳定，可信度不高，应用较少。

3 结语

精子获能是受精的重要因素。自精子获能被发现以来，对精子获能的研究特别是体外获能、获能的评价等已经取得了很大的进展。对精子获能的变化，包括精子质膜结构与生物化学特性发生系列改变，质膜胆固醇含量减少，膜的离子渗透性增加，膜的超极化，胞内pH升高，Ca2+和cAMP含量增加，超氧阴离子生成量增多，以及特异蛋白质的酪氨酸磷酸化增强等现象进行了研究。而由于精子获能的分子机制相当复杂，且受到多种细胞信号途径的调控，目前尚未明确，有待进一步研究。

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