软骨发育不全的产前诊断进展

朱 泓，杨祖菁

(上海交通大学医学院附属新华医院妇产科，上海 200092)

软骨发育不全的产前诊断进展

朱 泓，杨祖菁

(上海交通大学医学院附属新华医院妇产科，上海 200092)

软骨发育不全是最常见的遗传性侏儒，作为一种严重的遗传性疾病，该病发生后难以治疗。近年来，由于产前诊断方法及分子生物学诊断技术的发展，软骨发育不全的产前基因诊断成为可能。本文就该病的产前诊断技术尤其是基因诊断这方面进展进行综述。

软骨发育不全;胎儿;基因诊断

软骨发育不全(Achondroplasis，ACH)是人类骨骼发育异常中常见的类型，又称胎儿型软骨营养障碍(Chondrodystrophia fetalis)，其基本病理变化是骨骺生长板区软骨细胞的生长及成熟发生障碍，导致软骨内成骨障碍［1－3］。其基本的病理改变发生在软骨化骨过程［4］，从胚胎内开始骨化时即已出现，骨骺软骨细胞可发生增殖，但不进行正常的钙化与骨化。临床表现主要为个体矮小，头大，前额圆凸;鼻梁下陷，上颌骨发育不良，随年龄增长而更趋明显。我国ACH的发生率为18/100万，围产期死亡率为1/10万［5］，该病外显率为100%，完善产前诊断技术将大大减少此类缺陷儿的出生。

1 遗传概况

ACH的发病与遗传有密切关系，为常染色体显性遗传。纯合子患者的子女100%发病，杂合子患者的子女发病概率为50%。由于不少病人不结婚或难产，致使无下一代，因而影响到遗传形式。有统计显示80% －90%的病例没有家族史，为散发性病例，实际上是一种基因突变的结果。临床观察表明，父亲年龄大者生育软骨发育不全患儿的机率明显升高，故认为其基因突变只发生在父系染色体，往往在受精之前即已发生，在精子发生过程中影响DNA复制和修复的因素，会增加基因突变的发生率［6］。但是，Tiemann等［7］专门研究了男性精子细胞的基因突变，发现与年龄并无明显相关性。也有观点认为，任何可能导致基因改变的外界因素都有可能导致软骨发育不全的发生，如接触紫外线、X射线、致突变的化学物质等。

2 ACH与FGFR3基因突变的关系

在不断的研究过程中，人们对软骨发育不全(ACH)有了逐步深刻的认识。Shiang等［8］将ACH的致病基因定位于4号染色体短臂t末端，不久Rousseau等［9－10］几乎同时发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)跨膜区基因第1138位核苷酸的突变是ACH发病的原因。FGFR3有19个外显子和18个内含子，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区以DNA测序发现，绝大多数的突变是第1138位核苷酸G—A碱基转换，少数为G—C转换，这两种突变都导致了FGFR3跨膜区第380位密码子的错义突变(甘氨酸 Gly 替换为精氨酸 Arg)［8－10］，是骨关节先天畸形中发生基因突变率最高的。FGFR3在骨骼发育初期的软骨中表达水平最高，FGFR3与配体FGF结合后，引发耦联和自磷酸化作用，通过干扰软骨细胞的增生和分化抑制软骨化骨过程。FGFR3跨膜区基因1138位核苷酸突变后［11－13］，引发 FGFR3功能持续地、不依赖配体地激活，甚至在饱和浓度的配体中，突变的受体也拒绝配体介导的调控。这导致FGR3对骨骼生长的负向调节作用失控。近年另有学者分别在欧洲和日本ACH患者中发现了FGFR3基因1123位G—T颠换，导致375位密码子的突变，即由半胱氨酸代替了甘氨酸，表明ACH与其他遗传性疾病一样存在着等位基因的异质性。

3 产前影像学诊断

ACH的产前诊断常常是通过孕中、晚期的超声检查来诊断，B超下可见［14－15］胎儿头大、短的股骨、胫骨和腓骨，三叉形态的和“古钟”样胸腔，胎儿腹部膨隆，腹围增大，胎儿四肢短小，长管骨短粗且伴有弯曲，骨端膨大;羊水量增多。通过测定胎儿各长骨的长度、双顶径、头围、胸围、腹围、心/胸比值、足底长度等参数，观察骨的长度、形态及骨化程度，可对约31%－39%的某些特定类型病例做出诊断。对于孕周确切的胎儿，长骨测量值低于预测值两倍标准差以上时应考虑胎儿有软骨发育异常。超声对先天畸形的检测有较高的诊断价值，是初步筛查软骨发育不全的理想方法，但仅能在孕中、晚期进行诊断，故也有一定的局限性。

在实际工作中，当胎儿骨骼畸形的形态改变在二维超声中不十分典型或者相互雷同时，最好用三维超声来确诊，在三维超声中，可见胎儿五官分布不协调，眼距稍宽，鼻梁稍塌，四肢短而弯曲，以近端长骨短为主，躯干长度正常，与四肢不成比例。三维超声可以明显地提高图像的时间和空间分辨力，Krakow等［16］认为三维超声成像技术比普通的产科B超更容易发现异常。

宫内三维螺旋CT、MRI可在先天性骨骼发育异常的产前诊断中发现更多的异常征象，是对二维超声检查的有益补充。

4 产前基因诊断

4.1 胎儿DNA采集

4.1.1 母体血中富集胎儿DNA 长期以来，研究者一直试图找到一种安全、可靠、对胎儿无任何损害的产前诊断方法。Saito等［17］用B超检查1例妊娠妇女，怀疑其胎儿患有软骨发育不全。为进一步证实，将PCR技术与限制性片段多态性法相结合，扩增并分析血浆中胎儿的成纤维细胞生长因子受体3基因片段，结果证实该片段上的1138位点上的G为A所取代。尽管胎儿细胞存在于母体外周血中已被许多学者所证实，但是由于其数量少、个体差异及不同妊娠周的含量不同，使其难以成为临床实用的非创伤性产前诊断的检测方法。现在，利用母血浆中的胎儿DNA进行产前诊断还在实验室阶段。若要从实验室走向临床，尚需解决的问题有:首先必须改进从血浆中提取胎儿DNA的方法以获得高产量、高浓度的DNA模板;其次必须简化检测的环节，尽量早日实现自动化，以减少检测操作过程中的污染。

4.1.2 超声引导下经皮脐静脉穿刺 超声引导下经皮脐静脉穿刺术获取纯胎儿血标本，再从胎儿血中提取DNA，对快速胎儿染色体核型分析、基因异常、胎儿遗传代谢缺陷等有诊断价值，是其他方法无法比拟的。但因其为入侵性的产前诊断方法，应正确掌握指征，避免对母体及胎儿的损伤。提高手术的成功率及安全性，是普遍推广应用的关键。为此必须高度重视超声引导下经皮脐静脉穿刺术的原则。

4.1.3 绒毛活检术 绒毛活检术(Chorionic villus sample，CVS)给胎儿的遗传研究提供了可靠的研究材料。在孕早期细胞生长活跃时通过组织培养迅速获得较羊水更多的细胞，从而可以更早期、准确地实现产前诊断。标本可直接用于细胞染色体核型分析或培养后进行生化或基因图谱［18］。Antoniadi等［19］用此方法对包括软骨发育不全在内的多种遗传病进行了基因诊断，并认为如果操作规范这是避免来源母体DNA污染标本较好的方法。但妊娠丢失率较高，始终是临床颇感棘手的顾忌。

4.1.4 羊水细胞培养 目前，羊水细胞培养采用实时超声监测引导技术，使穿刺准确性提高，并且穿刺针的管径较小，可能降低胎儿流失率，是目前临床常用的方法。然而，由于羊水中活细胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意就会失败，即使培养成功，因分裂相少，形态不佳，达不到分析要求，无法进行进一步研究，如荧光原位杂交技术(FISH)等［20］，使羊水产前诊断的应用受到限制。

4.1.5 胚外体腔穿刺术 胚外体腔穿刺术是指孕早期在B超引导下，用穿刺针刺入孕囊内的胚外体腔，抽取液体用作产前诊断的一项新技术［21－22］，是目前可以开展的较早的产前诊断取材技术。胚外体腔穿刺术不穿破羊膜，可避免羊水渗漏的发生及对胎儿的直接损害;不损伤绒毛，与绒毛活检相比，可减少继发胎儿畸形的发生率;胚外体腔细胞来自胚外的中胚层，较少遇到假嵌合体问题。据报道，胚外体腔液中含有丰富的蛋白质、维生素、微量元素等［23－24］，抽取体腔液是否再生、体腔液的缺失是否对胎儿有远期影响，抽取体腔液的量与胎儿的近远期安全性的关系，仍需进行大样本、孕晚期、出生后的对照研究等。

4.2 基因诊断

4.2.1 PCR－单链构象多态性分析(Single strand conformation polymorphism，SSCP)ACH 最常见的1138位G—A突变可被限制性内切酶SfeI检测出，抽提软骨发育不全患者的DNA，PCR扩增含有FGFR3基因高发突变位点G380R区域，将PCR产物直接用限制性内切酶SfeI消化，15%PAGE凝胶电泳。电泳检测结果是软骨发育不全患者将出现正常PCR产物条带及其被内切酶消化后的两条带(109bp和55bp两条DNA片段)，而患者父母及正常人仅出现PCR产物相同大小单条带(l64bp的DNA片段)。PCR—限制性酶切法已成为检测这一已知最常见点突变的有效方法。但是，SSCP的检测条件可因DNA片段长度及核苷酸组成有较大差别，电泳条件可因突变类型不同而各异，故较难掌握;另外，可因加量不适当导致多态性条带，与正常条带重叠不易判断;另外还可由于变性不彻底而出现双链，特别是异源双链的干扰而影响实验结果的准确性［25］。

4.2.2 基因测序 FGFR3是ACH的致病基因，该疾病的发生99%以上是由于FGFR3基因第1138位核苷酸的G－A碱基转换或G－C碱基颠换(前一种突变占绝大多数)引起，这两种点突变均导致由该基因编码的成熟蛋白质的第380位的甘氨酸被精氨酸替代(G380R)［8－10］。对于有条件的实验室，可以直接通过对PCR产物的基因测序来检测FGFR3跨膜区基因的突变，将测序结果和正常基因序列对照，若能发现第1138位核苷酸发生G－A或G－C的碱基转换则可确诊为软骨发育不全，若与正常序列相同则可完全排除。由于基因测序尚不能保证100%的准确性，故应取不同PCR产物从两端分别进行测序才能确诊。

4.2.3 基因芯片技术 基因芯片(Gene chip，DNA chip，DNA microarray)将大量的核酸分子同时固定在载体上，一次可检测分析大量的 DNA和RNA，解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等的缺点［26］。Pinar等［27］研制出诊断软骨发育不全的电化学芯片，并成功地用于软骨发育不全的基因诊断。基因芯片诊断不但可以明确有无突变，而且能明确突变类型，高密度芯片诊断能达到与基因测序一样的准确性，并且能够明确患者是杂合子还是纯合子，产业化的芯片相对基因测序也更易于普及。目前，该技术在软骨发育不全的基因诊断领域已显示出重要的理论和应用价值。

4.2.4 胚胎植入前诊断 植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)在胚胎植入子宫前进行诊断，经检测胚胎无待测的遗传缺陷时才被植入子宫。Rechitsky等［28］已经成功地开展了软骨发育不全的PGD。但是，因为软骨发育不全80%以上无家族史，仅对患者进行PGD是不安全的，确保无任何遗传病变婴儿的出生，是产前诊断的最终目标。对每例移植胚胎均在植入前进行软骨发育不全的突变筛选才是最安全的。

5 展望

软骨发育不全畸形儿的出生给产妇及其家庭造成了巨大的心理和生理痛苦，为避免畸形儿出生，产前诊断已广泛用于围产期保健。提高先天性软骨发育不全的产前诊断是广大妇产科工作者的重要任务，也是提高我国优生优育水平的重要措施。我们建议将产前超声检查作为常规筛查，发现胎儿肢体短小时，应行胎儿染色体检查，排除染色体畸变，如21三体儿、18三体儿往往出现长骨短小。对于疑为先天性骨骼发育异常的胎儿，产前超声检查常难以确定其特定类型，对胎儿遗传物质的基因诊断是确诊的最佳标准。而软骨发育不全的胚胎植入前诊断将是软骨发育不全夫妇生育健康后代的希望。

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R681.1

A

1003—6350(2010)09—118—04

朱 泓(1979—)，女，上海市人，主治医师，硕士。

2010－03－05)

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