PCR检测技术在食源性致病菌检测中的应用

董安珍

聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）简称PCR，是20世纪80年代中期Cetus公司RaryB.Mullis等人发明的一种体外酶促基因扩增技术。它是在体外模拟自然DNA复制过程，利用人工合成的两个寡核苷酸引物，分别在靶DNA序列的两端与两条模板链分端互补的物性经过DNA变性，模板一引物复性和在taqDNA聚合酶催化下引物链的延伸反应，如此经过变性、复性和延伸约30个循环，就可能在短时间内将靶DNA扩增数百万倍作为分子生物学方法。PCR法具有快速、简便、灵敏的特点，是检测致病菌的发展方向。

1 常规PCR技术在食源性致病菌检测中存在的问题

常规PCR技术在食源性致病微生物检测的实际应用中表现出特异性强、灵敏度高、速度快、简便、高效等特点，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。但是在实际应用中也存在一些不足的地方：（1）食品中的一些糖类、酸类物质及油脂等会干扰Taq聚合酶的作用，影响PCR反应的正常进行。（2）在食源性致病微生物检测过程中，可能从环境及中间处理环节带来一些潜在的PCR反应抑制剂和一些其他物质，影响PCR反应，导致假阳性或假阴性结果的出现。（3）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。（4）靶序列或扩增产物的交叉污染。这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。

2 不同PCR技术的特点

常规PCR技术有其不足之处，不能满足致病菌检测的快速准确的要求。为了提高检测效率，根据PCR原理使用了如下技术应用于微生物的快速检测中。

2.1 RT-PCR技术（Real-timePCR）

实时定量PCR检测技术保留了常规PCR检测的特异性和敏感性，整个过程由电脑控制，从加样到结果只需要2h左右，可同步完成多个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的检测处理，极大地提高了检测效率，为食品污染的监测和食物中毒事件的快速反应提供了技术支持。尽管实时定量PCR检测比较昂贵，但由于其能对样品中细菌的污染程度进行定性及定量分析，且灵敏度高于传统PCR，更易于自动化，必然会成为细菌检测的常规手段。

2.2 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术。它克服了传统PCR易污染、假阳性率高的缺点，具有操作简单，结果直观、可靠，重复性、特异性好，灵敏度高，可定量等优点。可通过电脑软件实现实时在线检测PCR扩增过程得到最终检测结果，而无需对扩增产物再次检测，从而避免了污染。荧光定量PCR还可以实现一管多检，同时检测几个项目。荧光定量PCR技术的这些特点使得它在食品中进行病原检测和疫病监测时具有其他检测方法无可比拟的优越性，因而成为越来越重要的一种检测手段。

2.3 PCR-ELISA技术

PCR-ELISA是在微孔板上对PCR产物进行的快速、非放射性检测。应用PCR法容易出现假阳性，PCR-ELISA引入了探针，具有引物和探针双重的特异性，并且具备了PCR技术灵敏、快速的特点。PCR-ELISA技术是在PCR基础上结合了ELISA这种同样具有高度敏感性的检测手段，使生物信号在反应过程中逐级放大。因为PCR-ELISA技术是一个半定量的检测技术，具有引物和探针的双重特异性，并且酶标仪读数的客观性，使实验结果特异性增强，灵敏度提高，避免了PCR检测易出现的假阳性结果，同时检测设备只需普通PCR仪和酶联免疫仪，设备价格低，可以在一般实验室推广使用。

2.4 免疫磁珠PCR技术

免疫磁珠是免疫学和磁载体技术结合而发展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。在经过短时间的前增菌后，用免疫磁珠法捕获目的菌，在磁场的作用下与其他物质分离，用捕获的目的菌制备模板DNA，经过PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显像进行检测，该法有效缩短了检测时间，提高了传统PCR法的检出率，检测设备只需用普通PCR仪，可以在一般实验室推广使用。

2.5 套式PCR技术

套式PCR，又称巢式PCR，是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部），结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异，检测设备只需普通PCR仪，可以在一般实验室推广使用。

食品中的致病菌检测方法很多，主要有传统的细菌培养、PCR、免疫学方法等。传统的细菌培养程序繁琐，至少需要几天才能得出结论，难以适应快速简便的要求。常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高。相比之下，RT-PCR和荧光定量PCR克服了PCR的缺点，但实验仪器试剂价格昂贵，不利于一般实验室采用。PCR-ELISA技术、免疫磁珠PCR技术、套式PCR技术结果可靠、特异性强、灵敏度高、实验仪器试剂价格相对较低，可在一般实验室采用，但操作相对复杂，不可定量检测。操作者可根据实验室条件选择合适的快速检测技术。

如何利用新技术、新手段尽量消除或减少由于人为因素引起的误差，提高检验结果的准确性和客观性，同时达到良好的检测效果，仍然是致病菌质量控制工作中值得探讨的问题和尝试的新方向。PCR检测技术目前已经在国际上获得广泛的认可，在很大程度上可消除或减少生化鉴定和血清学试验，许多步骤依靠操作者的主观判断等主观因素造成误差，并且具有节约时间、简化工作量的优点，有益于在今后致病菌检测中使用。

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