60 Co-γ射线辐射对家蚕抗菌肽诱导效应研究

代君君 范 涛 周业奉 魏国清 范后文 肖林珍 吴传华 王储炎 田善富

(1安徽省农业科学院蚕桑研究所,安徽合肥 230061;2合肥永丰畜禽有限公司,安徽合肥 231200;3安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥 230036)

近年来,随着青霉素等传统抗生素长期、广泛地使用,许多细菌都产生了明显的抗药性,已对人们的健康产生了严重的威胁,寻找安全可靠的抗生素的替代品已成为一个热点问题。抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体免疫防御系统产生的一类抵抗外源病原体的防御性多肽类活性物质,是生物体先天免疫的重要组成成分,在机体的先天非特异性免疫中起着非常重要的作用[1]。大量研究证明,与普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌谱”更广,抗菌肽不但能杀死抗药病原菌,在使用过程中也不易使病原菌产生耐药性突变,而且它能抑制细菌产物诱导产生对人体有害的细胞因子[2],因而极有希望开发成为一种新型的广谱高效抗菌药物。

根据氨基酸的组成和结构特征,抗菌肽可分为天蚕素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)和蜂毒素(melittins)[3]等类型。由于抗菌肽具有无毒副作用、无残留、无细菌耐药性、热稳定、水溶性好、广谱杀菌等优点,且对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能[4];因此,在农业、畜牧业等领域中有着广阔的应用前景。

家蚕抗菌肽是其血淋巴中产生的具有抗菌活性的小分子多肽,在家蚕的天然免疫中起着至关重要的作用。由于在生物体内天然抗菌肽含量很少,化学合成抗菌肽的成本太高,且抗菌肽的分子量较小,难以分离纯化,价格昂贵,严重制约了抗菌肽在生产上的应用;故探索如何获得大量天然的抗菌肽,具有非常重要的意义。本研究采用不同剂量的60Co-γ射线对几个家蚕品种进行辐射处理,测定其抗菌肽的抑菌效果,研究结果对开发抗菌肽提供了一定的理论依据,也为家蚕的综合利用探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试家蚕品种：871×872、872×871、菁松×皓月、皓月×菁松,由安徽省农业科学院蚕桑研究所提供;供试菌种：枯草杆菌,由安徽农业大学微生物教研室提供;主要试剂：琼脂、牛肉膏、蛋白胨、LB液体培养基等,购自上海生工生物工程技术服务有限公司,其它试剂均为国产分析纯。主要仪器：L YO-2真空冷冻干燥机;G L-2L M型高速冷冻离心机;HP x-96MB E数显电热培养箱;MLS-375三洋高压灭菌锅;PHS-4CT型精密酸度计等。

1.2 试验方法

1.2.1 抗菌肽的诱导与提取 参照文献[5]的方法,将5龄第2天的871×872、872×871、皓月×菁松、菁松×皓月的家蚕,分别用60Co-γ射线辐射,辐射剂量为20 Gy(辐射8 min)、50 Gy(辐射20 min)、100 Gy(辐射40 min),以不作辐射处理的为对照区;每个品种、每个处理20头蚕,4个重复,共计48个小区。辐射处理后的蚕正常饲养24 h之后,放到-30 ℃冰箱中保存备用。60Co-γ射线辐射在安徽省农业科学院农产品加工研究所完成。

采用乙酸浸提法[6]提取不同蚕品种的抗菌肽,取用经过辐射处理后的不同处理的5 龄家蚕,分别称量、剪碎并用组织捣碎机捣碎、匀浆,然后用等体积的5%乙酸混合,在4 ℃条件下搅拌过夜后隔水煮沸15 min,迅速冷却。混合物在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心30 min后,取上清液放入冰箱在4 ℃条件下保存;沉淀物用等体积的5%乙酸混合,再次在4 ℃条件下搅拌、浸提过夜,重复上述离心过程,取上清液,合并2次上清液,将pH值调整为7.0,再次离心,弃沉淀,将上清液用液氮快速冷冻后,在真空压力15 Pa、-65 ℃条件下进行冷冻干燥,收集冻干粉即为家蚕抗菌肽类物质的粗制品。

1.2.2 家蚕抗菌肽类物质抑菌活性的测定 按普通培养基的配制方法配制培养基[7],放入高压灭菌锅中高压灭菌后备用。将枯草杆菌在普通固体培养基上培养24 h后,取生长良好的菌落放在液体培养基内,在37 ℃摇床上培养24 h,备用。另取5 mL经过灭菌的普通固体培养基于9 cm培养皿中,冷却到45 ℃左右温度后,加上述枯草杆菌的菌液1 mL,迅速摇匀,待冷却凝固后再进行下一步操作。

抑菌活性的测定参照葛兆宏[8]的纸片扩散法进行,取直径为1 cm灭菌后的圆形滤纸片,每片滤纸均匀地涂上不同品种、不同处理的家蚕抗菌肽类物质的上清液70 μL,然后均匀地排列在装有固体培养基的培养皿中。移至培养箱中,37 ℃培养24 h,观察抑菌圈,测定抑菌圈的大小,用抑菌圈的直径来反应抗菌肽活性的高低。

1.3 数据处理

分别记录4 个家蚕品种、3 种不同60Co-γ射线辐射处理对枯草杆菌抑菌圈的直径,并对数据进行方差分析,说明不同处理、不同品种家蚕产生的抗菌肽,对枯草杆菌的抑菌效果和对家蚕抗菌肽抑菌能力的影响。

2 结果与分析

2.1 不同辐射剂量不同家蚕品种的抗菌肽对枯草杆菌的抑制作用

4个不同家蚕品种的5龄蚕经过不同辐射处理产生的抗菌肽,对枯草杆菌都有明显的抑制作用。从抑菌圈直径大小来看,不同家蚕品种的5龄蚕经过不同剂量60Co-γ射线辐射处理后产生的抗菌肽,对枯草杆菌的抑菌效果都有不同程度的增加,采用20 Gy的60Co-γ射线辐射处理的抗菌肽,对枯草杆菌的抑菌效果最好(图1),其次是采用50 Gy和100 Gy的60Co-γ射线辐射后产生的抗菌肽对枯草杆菌的枊菌效果。从采用20 Gy的60Co-γ射线辐射不同家蚕品种产生的抗菌肽对枯草的抑菌效果来看,872×871抗菌肽的抑菌效果最好,对枯草杆菌的抑菌圈直径为3.00 cm,比对照的2.10 cm提高了42.9%;871×872抗菌肽的抑菌效果其次,对枯草杆菌的抑菌圈直径为2.57 cm,比对照的1.97 cm提高了30.5%;皓月×菁松与菁松×皓月抗菌肽的抑菌圈直径相同,均为 2.20 cm,分别比对照提高了22.2%、27.2%(表1)。

表1 不同辐射剂量不同家蚕品种的抗菌肽对枯草杆菌的抑菌圈直径

采用不同剂量的60Co-γ射线对家蚕进行辐射处理后,家蚕抗菌肽的抑菌圈直径比对照组的抑菌圈直径显著增大,这表明60Co-γ射线辐射家蚕后其抗菌肽的抑菌活性增强,但不同品种之间的抑菌圈大小有所不同,不同辐射剂量处理对家蚕抗菌肽的抑菌活性也各不相同;但其抑菌活性表现出相同的规律,即在不同品种之间的抑菌活性为872×871＞871×872＞菁松×皓月＞皓月×菁松;在不同剂量之间是低剂量60Co-γ射线辐射的抗菌肽抑菌效果最高,随着辐射剂量的增加,抗菌肽的抑菌效果有减弱的倾向。

图1 20 Gy辐射剂量处理不同家蚕品种产生的抗菌肽对枯草杆菌的抑菌效果

2.2 不同品种、不同处理对家蚕抗菌肽的抑菌效果

为进一步说明品种、辐射处理对家蚕抗菌肽抑菌效果的影响,我们对表1 不同辐射剂量不同蚕品种的抗菌肽对枯草杆菌的抑菌圈直径进行方差分析和F测验(表2),从表2可以看出,不同品种F值20.12＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,这说明品种间的抑菌差异达到极显著水平;不同辐照处理F值21.33＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,这说明不同辐照处理间的抑菌差异也达到了极显著水平。

表2 不同辐射剂量不同蚕品种的抑菌圈直径的方差分析

3 讨论

近年来,药物的滥用、残留和细菌耐药性等问题已经严重地威胁着人们的健康;因此,寻找安全高效全新类型的抗菌药物是解决上述问题的一条有效途径。抗菌肽因抗菌活性高、抗菌谱广、种类多、可供选择的范围广,靶菌株不易产生抗性突变等原因,而被认为有广阔的应用前景。虽然可从机体内提取抗菌肽,但含量极微,给其应用带来了极大的困难。为了能降低抗菌肽的生产成本,人们试图通过基因工程手段来大规模生产抗菌肽,现已人工设计合成了抗菌肽D、BD及AD基因,并且成功地将其导入酿酒酵母及毕赤酵母中进行表达[9-12]但工艺复杂,表达成本高,表达量有限,这也制约着抗菌肽的进一步开发与应用。本研究结果表明60Co-γ射线辐射可以有效增强家蚕抗菌肽的抑菌活性,这为开发和利用家蚕抗菌肽提供了基础。

为探索抗菌肽在农业生产中的应用,人们发现通过添食抗菌肽可以提高畜禽的抗病能力和促进畜禽的生长发育[13-14],但是由于抗菌肽分子量小、分离提取困难、价格昂贵等原因,严重制约着抗菌肽在生产上的应用。王海富等[15]尝试用人工饲养的蝇蛆养鸡,蛋黄大,胆固醇含量低且鸡极少生病,经济效益好;这为开展利用昆虫的天然抗菌肽提供了有效途径。家蚕是世界上饲养量最大的昆虫,其饲养技术成熟,可以大规模生产,家蚕抗菌肽研究也比较深入。因此,家蚕是新一代理想的高效抗菌剂载体。如果将家蚕直接作为饲料添加剂,既增加了饲料的营养成分,又省去了提取抗菌肽的中间环节,必将降低生产成本,为开展家蚕的综合利用提供了一条新的途径。

本研究表明,利用适量的60Co-γ射线辐射家蚕可以有效提高家蚕抗菌肽的抑菌活性,在本研究中只采用了生产上的2 对品种和60Co-γ射线进行辐射处理,仅测定其抑菌活性,没有对抗菌肽的类型进行鉴定;所以,不同品种、不同诱导源、不同诱导剂量所诱导的抗菌物质的种类和数量是否有差异,还值得进一步深入研究。

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