罗红霉素的百里酚蓝荷移分光光度法测定

李 俊 ,高成庄 ,王国庆 ,常方方 ,李全民

(1.焦作师范高等专科学校生化系,河南焦作 454000;2.郑州轻工业学院应用化学系,河南郑州 450002;3.河南师范大学化学与环境科学学院,河南新乡 453007)

0 前言

罗红霉素为半合成大环内酯类抗生素,主要作用于革兰氏阳性菌,厌氧菌,衣原体等。具有用量小,吸收快,作用时间长,稳定性好等特点。药典上记录的检测方法为抗生素微生物检定法[1],比较繁琐。已报道的分析方法主要有 HPLC[2-5]法、RHPLC[6-8]法、LC[9]法、SP[10]法、荷移反应[11-13]。本文首次利用百里酚蓝与罗红霉素在无水乙醇介质中的电荷转移反应,研究了最佳反应条件,该方法简便,快捷,条件易于控制,灵敏度高,线性范围宽,在可见光区即可完成测定。用于测定药物制剂中有效成分的含量,所得结果与文献[2]方法一致,同时测定了配合物的组成和稳定常数,并初步探讨了反应机理。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

UV-2800AH型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);722S分光光度计(上海棱光技术有限公司);CS501型超级恒温器(重庆试验设备厂制造)。1.0×10-2mol/L百里酚蓝(上海试剂三厂)乙醇溶液备用,稀释至5.0×10-4mol/L;2.5×10-3mol/L罗红霉素的乙醇溶液(对照品由中国药品生物制品检定所提供);所用有机试剂均为分析纯(天津市德恩化学试剂有限公司)。

1.2 实验方法

取适量罗红霉素乙醇溶液于5m L比色管中,浓度为3.1×10-4mol/L,加百里酚蓝溶液1.5 m L,用无水乙醇稀释至刻度,摇匀后室温放置10min,以试剂空白为参比,用1 cm比色皿在 438 nm处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

(1)吸收光谱。按实验方法配制溶液后,于 UV-2800AH紫外可见分光光度计上进行光谱扫描,由实验可知:罗红霉素在320580 nm处无吸收,百里酚蓝的最大吸收波长为 547 nm,荷移配合物的最大吸收波长为 438 nm,吸收光谱发生蓝移,波长变化 109 nm。吸收光谱图见图1,故选定检测波长为438 nm。

(2)反应温度的影响。按实验方法配制溶液,在不同温度的水浴中保温 10min,,取出冷至室温后测定吸光度,结果见表1。表1表明吸光度随反应温度的升高反而降低,说明该反应选择室温测定较为合适,因此选择室温测定。

(3)反应时间的影响。按实验方法配制溶液,放置不同的时间后进行测定,结果表明反应10 min后溶液吸光度A基本保持不变,且 10 h内稳定,本反应稳定性较好。

(4)溶剂的影响。百里酚蓝难溶于水,研究以甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇为有机溶剂时配合物的吸光度,分别为0.375,0.108,0.318,0.328。结果表明:乙醇效果最好。

图1 吸收光谱

表1 温度对荷移配合物形成的影响

(5)试剂用量的影响。其他条件不变,改变百里酚蓝的用量,按实验方法配置一系列溶液,室温放置10 min后测定吸光度值A,百里酚蓝的用量是0.5 mL,1.0m L,1.5mL,2.0mL,2.5m L时,吸光度值A分别为0.196,0.398,0.451,0.432, 0.420。结果表明百里酚蓝用量1.5 mL为宜。

(6)其他试剂的影响。考察了水及表面活性剂的影响,结果表明:CTAB、SDS、吐温-80、吐温-20的加入均使吸光度有不同程度的降低,见表2。

表2 水和表面活性剂对荷移配合物形成的影响

2.2 线性范围

按实验确立的最佳工作条件绘制工作曲线(见图2),将数据进行统计处理得回归方程为:A=0.296 9+0.000 62 C,相关系数r=0.999 9,罗红霉素在41.9419mg/L范围内呈线性关系,表观摩尔吸光系数ε为1.70×103L/(molcm)。

2.3 测定方法的重现性实验

按实验方法配制溶液8份,室温放置10 min后测定吸光度A分别为0.428,0.423,0.425,0.426,0.425, 0.427,0.422,0.424;s=0.002,RSD=0.47%。

2.4 配合物组成及稳定常数的测定

用连续变化法(见图3)和斜率比法(见图4)测定配合物的组成比为 1∶1,稳定常数为 1.53×106。

图2 工作曲线

2.5 反应动力学性质与反应机理探讨

(1)反应级数和反应速率方程的确定。按实验方法配制溶液,分别在 30℃和 40℃下反应,按初始速率法测定不同时间下吸光度,并由此计算不同温度下未络合的罗红霉素浓度。分别以A-t、1/A-t、In1/A-t作图,且都为一直线,由此可知:此荷移反应对罗红霉素为一级反应;由于在此反应中百里酚蓝远远过量,可视为常数,故此荷移反应可看作为假一级反应。速率方程为:

(2)表观速率常数和活化能的计算。将上述实验得到的 A-t数据用最小二乘法处理得 30℃和40℃的表观速率常数。又据阿累尼乌斯公式:ln k′=–Ea/RT+C,将各对k′-T数据代入公式:Ea=RT1T2/T2-T1lnk2′/k1′中计算出荷移反应的活化能,见表3。

(3)反应机理探讨。百里酚蓝是一个很强的平面型的 π电子受体,而罗红霉素是大环内酯类抗生素,富含电子,可以提供电子而与百里酚蓝形成 1∶1的配合物。

表3 表观速率常数和活化能

2.6 回收率实验

精密称取处方量辅料9份,分别按罗红霉素(150mg/L)标示量的80%、100%、120%加入标准品各3份,测定回收率,结果分别为100.2%、101.4%、100.8%,RSD分别为0.43%、0.49%、0.47%。

2.7 试样的测定

(1)试样的准备。取罗红霉素胶囊10粒(150mg/粒),精确称量,混匀,准确称取适量药粉,用乙醇溶解,转移到 100m L容量瓶中,用乙醇定容,摇匀,取续滤液使用。

表4 试样的测定结果

(2)试样的测定。取适量试样溶液于 5 mL比色管中,加入1.5m L百里酚蓝,按实验方法平行制3份溶液。测定吸光度A,按回归方程计算含量,与文献[2]对比,测定制剂中罗红霉素的含量。本法测定结果与文献[2]方法基本一致(150mg/粒),结果见表4。

[1] 中华人民共和国药典委员会,中华人民共和国国家药典:二部[M].北京:化学工业出版社,2000:388.

[2] 戴 红,胡昌勤.HPLC法分析罗红霉素及其片剂含量和相关物质[J].药物分析杂志,2002,22,(3):185-188.

[3] 王 芳,赖日禹.高效液相色谱法测定罗红霉素颗粒含量[J].药物分析杂志,2001,21(6):442-443.

[4] 田 洁,胡昌勤,张正行.罗红霉素及其有关物质快速HPLC分析方法的探讨[J].药物分析杂志,2003,23(6):434-437.

[5] 丁晨光,范 青,钟红玲,等.罗红霉素的HPLC测定[J].中国医药工业杂志,1998,29(3):122-124.

[6] 赵亚男,李相鸿,杨菁菁,等.RP-HPLC法测定人体血浆中罗红霉素的浓度[J].药物分析杂志,2006,26(5):618.

[7] 李伟华,闫惠平,黄 春,等.反相高效液相色谱法测定罗红霉素血药浓度[J].药物分析杂志,2006,26(8):1103-1105.

[8] 秦永平,黄 英,梁茂植,等.血清中罗红霉素的反相高效液相色谱法测定[J].药物分析杂志,1997,17(4):249.

[9] Maria Hedenmo,Britt-Marie Eriksson.Liquid Chromatographic Determ ination of the Macrolide Antibiotics Roxithromycin and Clarithromycin in Plasma Byautomated Solid-phase Extraction and Electrochemical Detection[J].JChromatogr A, 1995,692(1/2):161-166.

[10] 张敏波,张琪霞,金耀楚.罗红霉素片溶出度的分光光度测定[J].中国医药工业杂志,1996,27(6):260-261.

[11] 赵桂芝,李华侃.荷移分光光度法测定罗红霉素[J].光谱学与光谱分析,2003,23(1):157-159.

[12] 白秀珍,李华侃,刘中英,等.荷移分光光度法测定罗红霉素[J].药物分析杂志,2005,25(4):429-431.

[13] 李 俊,李全民,王新明.罗红霉素的荷移分光光度法测定[J].化学研究与应用,2006,18(9):1081-1083.