猪繁殖与呼吸综合病毒结构蛋白2b研究进展*

李 勇,夏志平,高英杰,马德慧

(1.解放军军事医学科学院军事兽医研究所重点实验室,吉林长春130062;2.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062;3.内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽028042)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,病毒粒子呈球形,直径为55 nm～60 nm,属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Ateriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus),同一家族的病毒还有马动脉炎病毒(Equine Arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)和猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)。根据病毒基因组核苷酸序列的不同,可将PRRSV分为2个基因型,即北美洲型(VR 2332)和欧洲型(LV)。目前我国发现的基因型均与美洲基因型的亲缘性接近。PRRSV全基因组长约15 kb。整个基因组含有9个开放阅读框架,分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7,其中ORF2～ORF7编码病毒结构蛋白,ORF1a和ORF1b编码具有聚合酶和解旋酶活性的非结构蛋白。Wu H F等[1]发现了一个不属于PRRSV任何已知开放阅读框编码的多肽,经研究该蛋白与EAV E蛋白生物学功能很相似,并命名为2b蛋白。

1 2b蛋白的发现及命名

1999年,Snijder E J等[2]报道在EAV内发现了E蛋白,一种新的结构蛋白,是由ORF2双顺反子编码,E蛋白的翻译起始密码子位于ORF2a起始密码子下游的两个核苷酸。与EAV E基因相似,对PRRSV进行基因组分析,发现ORF2中存在小的内部重叠阅读框ORF2b,编码一个分子质量为10 ku的蛋白,为了不与大结构蛋白GP5(E蛋白)混淆,将该蛋白命名为2b蛋白与之相区分。由于ORF2b的发现,故将原来的ORF2命名为ORF2a。

2 分子生物学特征

mRNA2同时编码ORF2a和ORF2b,则呈现为双顺反子(dicistronic)。ORF2b位于ORF2a内部,起始密码子位于ORF2a起始密码子下游的第6个核苷酸处。美洲型毒株ORF2b基因全长222 bp,编码73个氨基酸;欧洲型毒株ORF2b全长213 bp,编码70个氨基酸。2b蛋白非糖基化并与包内膜结合,包括一个C末端亲水氨基酸簇,有趣的是尼多病毒目其他动脉炎病毒,同样能编码小的疏水性囊膜,在病毒形态形成过程中发挥重要作用[3]。北美洲型病毒2b蛋白具有保守的豆蔻酰化和CK-Ⅱ磷酸化位点,在49和54核苷酸处包含两个半胱氨酸残基,其对病毒增殖是非必需的。研究发现2b蛋白并不能以二硫键的方式形成同型二聚体[4]。通过对感染猪血清中抗体的检测,证实欧洲型2b蛋白与GP2-GP3-GP4异质三联体结合,一起被整合到病毒体内,并在异质多聚体进入病毒过程中扮演重要的角色[5]。通过与GenBank中序列比对分析,发现北美洲毒株拥有第二个潜在的起始密码子,位于ORF2bAUG下游第9个核苷酸处,但它并不是一个翻译起始点,对2b蛋白的结构形成没有影响。在蛋白所有氨基酸中,发现第3、7、48、50、62处氨基酸较易发生突变,除第50和62位氨基酸突变影响2b蛋白结构外,其他突变因发生的都是同义突变而不影响蛋白结构的完整性。

3 生物学功能

2b蛋白作为新蛋白,其生物学功能需要不断的深入和完善。目前认为2b蛋白在病毒感染过程中起作用。交联实验证明,2b蛋白能通过非共价键与其他蛋白结合形成同型寡聚体,包括二聚体、三聚体和四聚体。而2b与N蛋白的结合仍需要进一步证实。为了进一步验证2b蛋白的生物学功能,用基因敲除的方法去除ORF2b的起始基因,2b蛋白不能表达,而PRRSV丧失感染细胞的能力GP2b-GP3-GP4三聚体不能进入病毒体内,缺少了任何一种小结构蛋白将减少2b蛋白聚合体进入病毒体的数量[6-7]。将没有了感染性的病毒进行细胞培养时,发现病毒仍然能通过受体介导的内吞作用进入细胞,并在胞内形成包涵体,使基因组不能释放,复制过程受阻[8]。此时胞内酸性环境使病毒膜蛋白发生构象变化,暴露出隐藏的促膜融合蛋白结合区域,使病毒囊膜和内涵体膜发生了融合(哪种细胞器引发了胞内酸性环境还不清楚),接着发生脱壳过程。脱壳是病毒感染的关键步骤,此步骤发生在衣壳破解,释放基因组进入细胞质并开始复制的过程中。有趣的是,不是PRRSV与细胞膜直接融合,也没有关于动脉炎病毒属具有促膜融合蛋白特性的报告。推测PPRSV可能有跨膜蛋白促进病毒感染早期内涵体的脱壳过程。应用一种抗流感病毒的药物金刚烷胺来验证其对PRRSV的阻断效果,电镜下观察发现PRRSV不能进行复制,表明PRRSV的确拥能够编码具有离子通道活性的蛋白,其活性是在感染时进行脱壳所必需的[9]。研究证明,2b蛋白能促进病毒粒子脱壳,而在粒子组装和释放中并没有发挥很大的作用。

2b蛋白主要集中在细胞核区,包围在内质网和高尔基体,与核膜相连。动脉炎病毒属病毒2b蛋白能够改变膜通透性,形成一种类似人工膜一样的通道,具有阳离子选择透过性。Lee C等[10]研究数据表明,PRRSV 2b蛋白能改变菌膜通透性,抑制细菌的生长,并能增加潮霉素B进入细胞的几率。然而用病毒感染或者2b基因转染哺乳动物细胞,却不能得到相同的结果,可能是由于2b基因在哺乳动物细胞内的定位不同。在PRRSV感染的Marc-145细胞内,2b蛋白出现在内质网和高尔基体上,有可能参与子代病毒的加工过程,而不是移动到细胞膜上。细菌体内没有细胞器,表达的2b蛋白则聚集在细菌内膜上,导致膜变性,因此增加了膜的透过性。2b蛋白没有改变哺乳动物细胞膜通透性,说明病毒进入细胞时膜结构破坏和细胞溶解不是2b蛋白的作用[11]。目前的研究证实,PRRSV 2b蛋白具有潜在的形成病毒孔的活性,有使病毒脱壳的离子通道的功能。然而,由2b蛋白介导的病毒感染细胞的离子通道类型(如Na+、K+、Ca2+、Cl—、H+等)还没有被确定。

4 免疫学特性

猪感染PRRSV后,体内能产生一系列的抗该病毒的特异性抗体,但体液免疫在免疫保护作用中的机制尚不完全清楚。在感染后的5 d～7 d出现抗PRRSV的IgM,随后的1周～2周消失;7 d～10 d后检测到抗PRRSV的IgG,之后1周～3周达到顶峰,并持续数月;抗PRRSV的IgA在感染后14 d首次检测到,24 d后达到最大值,38 d后消失[12]。2b蛋白特异性抗体首次出现在感染后第18、39天后达峰值,具有抗2b活性和免疫中和活性。当感染后25 d,几乎所有感染的猪都能检测到中和抗体,但滴度很小,中和抗体低是PRRSV感染的典型特点[13]。2b蛋白能促进IFN-γ的表达,可抑制在巨噬细胞中的复制,影响病毒蛋白的正常合成,还能增强巨噬细胞产生超氧阴离子的能力。用病毒接种细胞发现接种后大约6 h出现GP5,M,N蛋白,而2b蛋白在接种后15 h才大量出现,绿色荧光跟踪标记2b和GP2融合蛋白,结果显示两种蛋白都能表达,然而2b优先表达,是ORF2表达的主要产物[14]。

5 结语

2b蛋白不是病毒装配所必需的,但能促使PRRSV粒子脱壳,释放RNA到宿主细胞内,具有影响病毒复制的作用,因此对其功能的研究非常重要。作为一种离子通道蛋白,2b蛋白的功能和结构特征与A型流感病毒M2蛋白很相似,M2蛋白与病毒囊膜形成同型四聚体,具有典型的离子通道活性。通过M2通道移动使病毒体内形成酸性环境。结果M1蛋白从核蛋白复合体上分离下来,促进核蛋白复合体进入细胞核,流感病毒在此进行复制[15]。病毒离子通道的研究是病毒病治疗性药物筛选的主要方法和手段,为国内外研究的热点,目前主要集中在流感病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒等的研究上[16-17]。

PRRS目前没有特效治疗药物,人们更重视其免疫机理及疫苗研究,防止病毒侵入机体,以及抑制病毒在体内的复制成为防控该病的主要方向。2007年,我国南方地区发生的高致病性蓝耳病,最初被认为是由非结构蛋白Nsp2缺失了30个氨基酸使病毒毒力增强所致,试验证明事实并非如此[18]。我们假想2b蛋白的突变或其高级结构的变化使宿主细胞的膜通透性增强导致PRRSV的感染力增强,因此通过对该蛋白的研究,筛选出特效阻断性药物,以应对PRRSV抗原漂移和变异带来的后果,弥补当前PRRSV疫苗保护不力的现状。

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