猪链球菌分子生物学分型方法研究进展*

林荣高,黎满香,蒋 伟,陈 滔

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128)

猪链球菌(Streptococcus suis)是革兰阳性球菌,圆形或卵圆形,呈双或链状排列,是猪的最重要致病菌之一[1]。临床上可以引起猪脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎及突然死亡等,对养猪业造成严重影响[2-3]。1968年在丹麦首次报道猪链球感染人,截至2008年底世界所报道的病例超过400例[4],实际上受猪链球菌感染的人数远比报道的多[5]。1998年、2005年我国先后两次发生猪链球菌感染人后,人们意识到猪链球菌是一种威胁公共卫生的人兽共患病原。猪链球菌种类繁多,分型困难,兰氏法(lancefield)是应用较早的技术,可将猪链球菌分为R、S、T群,然而有相当部分菌株不能分群,许多地区特别是发展中国家分群血清难以获得且价格昂贵[6]。虽然按溶血性可将全部菌株分为α、β、γ三种类型,但过于笼统。利用耐药性和生化特性分型的方法也有一定价值,但难于统一和标准化,因为不同地区的分离株的生化特性和耐药性差异大[7]。根据荚膜多糖抗原差异,目前可将猪链球菌分为35个血清型,1～34型及1/2型,然而还是有相当部分菌株无法定型[8]。其中,猪链球菌2型被认为是流行最广,致病性最强的型,但2型猪链球菌(SS2)中也存在强毒株、弱毒株和无毒株[9],这说明同一血清型还存在亚型。在过去的研究中传统的分型方法起到重要的作用,然而还是存在不足,如区分度低、难于统一,往往只基于一类表型,描述菌株生物学特性差异的能力差。近年,分子生物学技术发展给猪链球菌分型带来了新的技术手段。

1 多位点序列分型

多位点序列分型技术(multilocus sequence typing,M LST)是一种基于PCR扩增、基因测序的基因分型方法。King S J等[10]对英国294株猪链球菌的4个管家基因进行扩增并测序,获得92个序列型(ST),ST1出现频率最多,该序列曾被6个国家共报道141次。此外,ST1多来自脑膜炎、关节炎和败血症的样本,ST27,ST87则主要来自肺脏,与临床背景相关良好。Princivalli M S等[11]对意大利2003年—2007年分离的菌株研究时也发现ST1主导着这几年的流行,并且大都携带MRP,EF,和suilysin基因。与欧洲报道相比,我国分离株则以ST7为主,其次是ST1。叶长芸等对国内两次暴发(1998年江苏、2005年四川)的猪链球菌进行研究,发现114株猪链球菌中有106株属于ST7,王洪敏等[12-13]的研究也有类似的结论,5株广东省人源SS2中有3株属于ST7,2株属于ST1。研究表明,ST7刺激T细胞增殖和诱导致炎因子释放的能力比欧洲流行株ST1更强[14]。Dang H等[15]从越南一名死者血液中分离到16型猪链球菌,经MLST分析证实其属于一个新的序列型,不同属以往报道的任一克隆系,该序列型很可能与16型猪链球菌有关。不难看出,MLST最大特点是不同的实验室获得的结果可以比较,易于统一,标准化,并可经互联网共享,现已有许多学者将该技术用于流行病学研究中。

2 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)是通过酶切细菌基因组,然后对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳,不断改变电场方向,从而在凝胶上获得多态性DNA图谱。Vela A I等[16]运用该方法可将西班牙74个畜群的302株猪链球菌分为60个基因型,其中45%的基因型由单一分离株构成。值得强调的是,该试验在同一血清型可以分出多个脉冲电泳型(pulsotypes),如9、2型、7型可分别获得24、10、6个脉冲电泳型。这就说明许多血清型中可能还存在亚型,而传统的分型方法很难描述同一血清型中菌株间的差异。Marois C等[17]在对来自扁桃体的猪链球菌研究时发现,利用荚膜多糖抗原法进行血清型鉴定时有58%菌株无法定型,说明荚膜抗原分型法不足以区分所有的猪链球菌,而应用PFGE技术进行基因分型在其研究中起到重要的作用。Berthelot-Herault F等[18]对法国的123个株猪链球菌进行PFGE研究,98%菌株获得定型并可归结为74种脉冲电泳型,按60%同源性归类可获取A、B、C 3个组,而来自临床病猪和人源分离株集中在B组,体现PFGE技术的相当高的区分度,并且分型效果能与临床相关。PFGE具有很高的分辨率,重复性好,但需要特殊的仪器和专业人员操作,可比性不及MLST,较难于统一标准化。不过我国正在建立各病原菌PFGE分析标准化操作规程,建立标准图谱数据库,即不同病原菌各自的酶切分析和电泳参数标准,其应用会越来越广泛[19]。

3 限制性片段长度多态性分析

Mogollond J D等[20]曾应用限制性片段长度多态性分析(RFLP)对猪链球菌进行研究,其操作简单归结为染色体DNA的提取,HaeⅢ和HindⅢ限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,直接分析DNA多态性图谱。研究发现用HaeⅢ消化时有23种血清型产生易于分辨的图谱,9、11、12、16型的DNA则对HaeⅢ消化产生抵抗。用HindⅢ获取的图谱中9型和16型有很大的差异。通过对110个菌株进行研究,获得多种DNA指纹图谱并与临床有相关性,表明DNA多态性技术可以用做流行病学调查的工作。Amass S F等[21]的用RFLP技术证明了仔猪的感染由垂直传播所致,从同群的3头母猪及所产的仔猪身上分离到5型猪链球菌,对菌株进行RFLP分析发现:从仔猪及其对应的母猪中分离到的菌株有相同的DNA指纹图谱,而与没有母源关系的样本的DNA图谱有较大差异。本试验利用DNA指纹图谱可以分辨亲缘很近的菌株间的差异,而传统方法则较难做到这一点。不过,RFLP技术操作也比较繁琐,多态性图谱不及AFLP和PFGE清晰,其很可能被其他分子技术代替。

4 扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术是由RFLP演变而来,其通过随机扩增限制性片段获取多态性。Rehm T等[22]对116株猪链球菌进行AFLP分析发现所有菌株可以分为A、B、C、D 4个群和A1、A2、C1、C2亚群。其中亚群A1主要由临床发病cps1菌株和mrp+epf+(或epf*)sly+cps2+菌株构成;mrp*cps9+菌株则归为A2;C1、C2主要由cps2、cps7肺炎菌株和epf—sly—菌株构成。AFLP分型与临床背景、毒力基因间有清晰联系,可以作为流行病学研究的一种手段。Baums C G等[23]对83株S.suis进行AFLP分析表明来自病猪并且携带mrp、epf、sly、cps2基因的菌株和cps2+野牛分离株可以归结为一类,而sly—epf—的SS2则归为另一类,两类的之间AFLP图谱同源性为45%,其AFLP分型效果与毒力基因有相关性。AFLP技术获得的多态性丰富,多态性图谱清晰并易于分析解释,但是操作也相对复杂,涉及DNA提取、酶切、PCR扩增和核酸标记技术。

5 随机扩增的多态性DNA

随机扩增的多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术是运用随机引物对菌株基因组DNA进行扩增,获取多态性DNA图谱。Chatellier S等[24]用随机引物对88株SS2的基因进行随机扩增,获得23种DNA多态性图谱,来源于人和猪的分离株具有共同的图谱,由此认为感染猪与人类的菌株可能是共同来源。结合各菌株的SLY、MRP、EF毒力基因检测,发现所有SLY+MRP+EP+菌株的PAPD图谱可以归结为一类,而SLY—MRP—EP—则可归为另一类,这与毒力基因之间有很好的相关性,因此利用该技术应用于猪链球菌乃至其他病原菌的毒力分析具一定的意义。试验还发现北美和欧洲的菌株具有相似的RAPD图谱,由此推定其有亲缘关系。与其他分子生物分型技术相比,RAPD技术操作简易,成本低,并且可以针对细菌全部基因组做随机检测,但其重复性较差,标准化困难。

6 核糖体分型

Staats J J等[25]运用核糖体分型(ribotyping)技术对猪链球菌毒力进行研究,经DNA提取、酶切、电泳分离、Southern blot后,用地高辛标记的16 S、23 S rRNA反转录cDNA作探针杂交。结果发现,强毒株具有与弱毒株、无毒株不同的杂交图谱。利用这种方法可以鉴定SS2的毒力。Smits H E等[26]用同位素标记一个1 066 bp的16sRNA基因片段作探针与42株猪链球菌的DNA片段杂交,结果显示致病SS2菌株和高致病SS1有不同的杂交图谱,无毒株之间的杂交图谱具有很高的同源性。也有报道[27]说用核糖体分型的方法发现脑膜炎菌株有独特的DNA图谱,并且对磺胺甲异恶唑具有耐药性,而来自肺炎、败血症、心包炎、心内膜炎菌株则属于另一类图谱且对四环素具有耐药性。这种方法涉及Southern印迹和核酸标记,比较耗时,成本高,难以在普通实验室广泛应用。

7 PCR-限制性片段长度多态性

PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是通过PCR扩增某个特定的DNA片段,然后对该片段进行RFLP分析。Marois C等[28]运用该法对138株猪链球菌进行研究,其选择的PCR扩增片段为部分16 S rRNA基因和部分23 S rRNA基因,以及16 S～23 S rRNA基因之间序列(intergenic spacer region,ISR),称之ISR-RFLP。结果表明,这种方法可以分辨95%以上的菌株,人源分离株间的基因差异小于猪源分离株,并且有两种基因图谱中为SS2菌株特有。23 S rRNA分子比较大(约3 kb),尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用,ISR比16 S rRNA相对变异大,因此应用16 S～23 S rRNA基因及ISR对亲缘近的菌株的分类和鉴定可以弥补了16 S rRNA序列的缺陷。就特定DNA片段分析而言,PCR-RFLP不及测序准确,但对大片段DNA测序的成本也是相当高。

8 基因测序

基因测序(sequencing)是根据16 S DNA差异对细菌分类是公认的一种理想方法。Rasmussen S R等[29]对几种血清型猪链球菌进行16 S DNA扩增并测序后进行遗传进化树分析,发现血清型9、20、26可以归结为一簇,血清型25、27、2、24、1、22可归结为另一相对独立的一簇。这项研究阐述了几种血清型间亲缘关系。Chatellier C等[30]对35种血清型的菌株的16 S RNA基因测序,分析后发现各参考株的核苷酸同源性在93.49%～100%之间,许多种血清型16 S RNA基因同源性很高。16 S RNA基因系统进化树中血清型32,33,34与其他菌株分属两相对独立分支。遗憾的是,16 S RNA基因的相对保守性,不能清晰地描述猪链球菌菌株之间的差异。相比之下,其他一些基因可能胜任,60 ku chaperonins基因(Cpn60)普遍存在并且高度保守已经被用于分类学和分子进化研究。Brousseau R等[31]对35种血清型的猪链球菌的部分Cpn60基因经行扩增、测序,经序列分析发现参考株的Cpn60基因系统进化关系和16 S RNA序列获得的进化关系相当吻合。此外,Cpn60基因较16 S RNA基因又有更多的变异,在区分菌株间的差异可能更有利。Kutz R等[32]对19株SS2的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase enzymes,GDH)全部及侧翼序列经扩增测序,发现菌株GDH基因是一个具有1 820 bp的片段,其中包含1 344个核苷酸的阅读框架,虽然菌株间核苷酸序列存在较多差异,但大多是沉默的。其中214、886、895、913、988基因位点的变异对应氨基酸变异为Tyr72-to-Asp、Thr296-to-Ala、Ala299-to-Ser、Glu305-to-Lys和Glu330-to-Lys。强毒株与中等毒力株、无毒力株相比,其发生了Ala299-Ser、Glu305-Lys和Glu330-Lys氨基酸置换,这就暗示基于GDH的分型法可以作为预测菌株致病情况的标志。

9 结语

与传统的分型方法相比,基于分子生物技术的分型方法体现了高灵敏性,简易性,能从基因水平反映菌株的生物学特性的差异。其中核糖体分型由于其操作复杂,较耗时,成本高,运用该技术对猪链球菌分型的报道不多,PAPD、AFLP、RFLP技术可以针对全基因组进行分析,PAPD操作最为简易,成本最低,AFLP则有多态性丰富,图谱清晰的特点,目前运用还比较多。PCR-RFLP和基因测序方法则针对部分基因片段,选择合适的基因片段至关重要,比起PCR-RFLP,测序方法可以精确扫描每个碱基、分辨力极高,不过成本也较高。MLST技术的可比性和PFGE的高分辨率最为突出,并能检测细菌基因组的多个位点,这使这两项技术越来越受青睐。总之,分子生物技术给细菌分型引入了新的思路,正如Zuckerkandl E和Pauling L曾谈到“分子是进化的历史文件”[33],以分子生物学技术将会成细菌分型的强有力手段,并将会是流行病学研究的重要工具。

[1] 陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2005:211.

[2] María C,Punaro D,Segura M.Streptococcus suisserotype 2,an important swine and human pathogen,induces strong sys-temic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection[J].Immunology,2007,179:1842-1854.

[3] Ma Y,Feng Y J,Liu D,et al.Avian influenza virus,Streptococcus suisserotype 2,severe acute respiratory syndrome-corona virus and beyond:molecular epidemiology,ecology and the situation in China[J].Phil Trans R Soc B,2009,364:2725 2737.

[4] Wertheim H F,Nghia H D,Taylor W,et al.Streptococcus suis:an emerging human pathogen[J].Clin Infect Dis,2009,48:617-625.

[5] Smith T C,Capuano A W,Boese B,et al.Occupational exposure to Streptococcus suisamong US swine workers[J].Emerg Infect Dis,2008,14:1925-1927.

[6] 倪宏波,王兴龙.RAPD技术及其在链球菌分型中的应用[J].动物医学进展,2002,23(2):29-32.

[7] 张纯萍,宁宜宝,宋 立.部分国家和地区猪链球菌的耐药性及耐药机制研究进展[J].中国兽药杂志,2007,41(3):29-31.

[8] Pan X Z,Ge J C,Li M,et al.The o rphan response regulator covR:a globally negative modulator of virulence in Streptococcus suis serotype 2[J].Bacteriol,2009,191:2601-2612.

[9] Gottschalk M,Xu J,Calzas C,et al.Streptococcus suis:a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen[J].Future Microbiol,2010,5(3):371-391.

[10] King S J,Leig h J A,Heath P J,et al.Development of a multilocus sequence typing scheme for the pig pathogen Streptococcus suis:Identification of virulent clones and potential capsular seroty pe exchange[J].Clin Microbiol,2002,40(10):3671-3680.

[11] Princivalli M S,Palmieri C,Magi G.Genetic diversity of Streptococcus suis clinical isolates from pigs and humans in Italy(2003-2007)[J].Euro Surveill,2009,14(33):pii:19310.

[12] Ye C Y,Bai X M,Zhang J,et al.Spread of Streptococcus suis sequence ty pe 7 in China[J].Emerg Infect Dis,2008,14(5):787-791.

[13] 王洪敏,柯昌文,潘武滨,等.2005年广东省临床分离猪链球菌的M LST分子分型研究[J].南方医科大学学报,2008,28(8):1438-1441,1445.

[14] Ye C,Zheng H,Zhang J,et al.Clinical,experimental,and genomic differences between intermediately pathogenic,highly pathogenic,and epidemic Streptococcus suis[J].Infect Dis,2009,199(1):97-107.

[15] Dang H,Nghia T,Hoa N T,et al.Human case of Streptococcus suis serotype 16 infection[J].Emerg Infect Dis,2008,14(1):155-157.

[16] Vela A I,Goyache J,Tarradas C.Analysis of genetic diversity of Streptococcus suis clinical isolates from pigs in spain by pulsed-field gel electrophoresis[J].Clin Microbiol,2003,41(6):2498-2502.

[17] Marois C,Devendec L L,Gottschalk M,et al.Detection and molecular typing ofStreptococcus suisin tonsils from live pigs in France[J].Can J Vet Res,2007,71(1):14-22.

[18] Berthelot-Herault F,Marois C,Gottschalk M,et al.Genetic diversity of Streptococcus suis strains isolated from pigs and humans as revealed by pulsed-field gel electrophoresis[J].Clin Microbiol,2002,40(2):615-619.

[19] 聂小想,沈志强,崔言顺,等.脉冲场凝胶电泳技术在猪链球菌分型中的应用[J].动物医学进展,2008,29(1):70-73.

[20] M ogollon J D,Pijoan C,Murtaugh M P.Characterization of prototype and clinically defined strains of Streptococcus suis by genomic fingerprinting[J].Clin Microbiol,1990,28:2462-2466.

[21] Amass S F,Sanmiguels P,Clark L K.Demonstration of vertical transmission of Streptococcus suis in swine by genomic fingerprinting[J].Clin Microbiol,1997,35(6):1595-1959.

[22] Rehm T,Baums C G,Strommenger B,et al.Amplified fragment leng th polymorphism of Streptococcus suis strains correlates with their profile of virulence-associated genes and clinical backg round[J].Medical Microbiol,2007,56:102-109.

[23] Baums C G,Verkhlen G J,Rehm T,et al.Prevalence of Streptococcus suis genotypes in wild boars of northwestern Germany[J].Appl Envir Microbiol,2007,73:711-717.

[24] Chatellier S,Gottschalk M,Higgins R,et al.Relatedness of Streptococcus suis type 2 isolates from different geographic origins as evaluated by molecular fingerprinting and phenotyping[J].Clin Microbiol,1999,37:362-366.

[25] Staats J J,Plattner B L,Nietfeld J,et al.Use of ribotyping and hemolysin activity to identify highly virulent Streptococcus suis type 2 isolates[J].Clin Microbio,1998,36:15-19.

[26] Smith H E,Rijnsburger M,Stockhofe-Zurwieden N,et al.Virulent strains of Streptococcus suisserotype 2 and highly virulent strains of Streptococcus suis serotype 1 can be recognized by a unique riboty pe profile[J].Clin Microbiol,1997,35:1049-1053.

[27] Rasmussen S R,Aarestrup F M,Jensen N E,et al.Associations of Streptococcus suis serotype 2 ribotypes profiles with clinical disease and antimicrobial resistance[J].Clin Microbiol,1999,37:404-408.

[28] Marois C,Devendec L L,Gottschalk M,et al.Molecular characterization of Streptococcus suis strains by 16S 23S intergenic spacer polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis[J].Can J Vet Res,2006,70(2):94-104.

[29] Rasmussen S R,Andresen L O.16s rDNA sequence variations of some Streptococcus suis serotypes[J].Syst Bacteriol,1998,48(3):1063-1065.

[30] Chatellier C,Harel J,Zhang Y,et al.Phylogenetic diversity of Streptococcus suis strains of various seroty pes as revealed by 16 s rRNA gene sequence comparison[J].Syst Bacteriol,1998,48:581-589.

[31] Brousseau R,Hill J E,Préfontaine G,et al.Streptococcus suis seroty pes characterized by analysis of chaperonin 60 gene sequences[J].Appl Environ Microbiol,2001,67(10):4828-4833.

[32] Kutz R,Okwumabua O.Differentiation of highly virulent strains of Streptococcus suisserotype 2 according to glutamate dehydrogenase electrophoretic and sequence ty pe[J].Clin Microbiol,2008,46(10):3201-3207

[33] 陈文新.细菌系统发育[J].微生物学报,1998,38(3):240-243.