转基因表达的时空调控*

杜 丽,孟庆文,满处日嘎,王凤阳*

(1.海南大学农学院 海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室(筹) 海口市动物基因工程重点实验室,海南海口570228;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150001)

1982年Palmiter等将金属硫蛋白(metalloprotein,MT)启动子和生长激素基因拼接后导入小鼠受精卵的雄原核,获得整合和表达该外源DNA的转基因“硕鼠”,近年来转基因动物技术已广泛应用于生命科学研究的诸多领域[1-2]。

为了对转基因表达产物的合成与加工进行动力学分析,寻找影响转基因表达的相关因素,探究某些功能基因在模型动物一定发育阶段的生理作用。从早期的金属离子诱导、热激、激素等调控系统到四环素诱导,以及基于多种组织特异性的启动子的转基因表达的调控系统相继建立,并成为转基因动物研究的一个重要组成部分[3-7]。下面对转基因表达调控系统的研究进展进行综述。

1 基于四环素(tetracycline,Tet)的调控系统(Tet on/off系统)

该系统一般包括:①组织特异的启动子、四环素反应转录活化因子(tet responsive transcriptional activator,tTA)或反式tTA(reverse tet responsive transcriptional activator,rtTA)组成的调控质粒;②由四环素操纵子(tet operator,TetO)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、目的基因组成的响应质粒。通过两轮转染,经G418、潮霉素/嘌呤霉素筛选,建立相应的的稳定细胞系,在培养基含有四环素(或强力霉素,doxycyclin)或不含有四环素(或强力霉素)的条件下,转基因的表达受到调控[8-10]。

Tet on系统建立后,广泛应用于酵母、果蝇、小鼠、大鼠、多种细胞系及植物。但是,在某些动物的某些器官,强力霉素一定程度的无效诱导,rtTA mRNA原核部分序列的不稳定性,及其在强力霉素不存在的条件下,rtTA与TetO残留的结合等因素所导致的靶启动子的背景活性升高等缺陷在很大程度上限制了其应用。针对上述不足,Urlinger S等[11]以增强型绿色荧光蛋白(enhenced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,对运用PCR方法建立的突变rtTA DNA的文库进行筛选,在酵母中得到了背景更低,敏感性更高的rtTA突变体-rt-TAs-M2。强力霉素诱导试验表明,与野生型rtTA相比,rtTAs-M2对于强力霉素的需要量低10倍,而且更稳定,无强力霉素时,无背景表达。

TetR在真核细胞中表达时,存在于TetR编码区中部潜在的剪切方式会导致非必要mRNA的产生,为了解决这一问题,Stebbins M J等[12]去除了TetR基因中部的潜在剪切位点,同时在rtTA表达框两侧插入果蝇边界元素,以消除整合位置对表达的影响,结果发现,日粮中低水平的强力霉素(10 μ g/mL)可以有效、迅速诱导转基因在果蝇模型的胚胎、幼虫和成虫等阶段的表达。

为了探讨超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,EC-SOD,Sod3)的病理生理作用,Zou Y等[13]通过将Sod3转基因小鼠与可诱导的组织特异转录激活因子转基因小鼠杂交,建立了四环素诱导的组织特异表达Sod3的转基因小鼠,进一步的分析表明,肝特异性表达Sod3的转基因小鼠EC-SOD水平增加,神经元特异表达Sod3的转基因小鼠ECSOD水平在海马和大脑皮层增加,小鼠食物中添加的强力霉素能够开启或关闭转基因的表达。

2 基于酵母转录激活蛋白Gal4的时空调控系统

基于Gal4及其结合位点的上游激活序列(upstream activation sequence,UAS)建立的转基因表达的时空调控系统一般包括:①由Gal 4的DNA结合结构域与人的雌激素受体的C端融合在一起的调控质粒;②数个UAS、TATA盒、目的基因组成的Gal 4响应质粒。整合有调控质粒和响应质粒的细胞或模型动物,在雌激素存在的情况下,Gal4的DNA结合结构域得到表达,并结合到响应质粒的UAS序列启动靶基因的表达。由于绝大多数哺乳动物既不表达内源性的雌激素受体,也不表达任何Gal4样活性的蛋白,因此,该系统具有较强的选择性。

Braselmann S等[14]将单纯疱疹病毒蛋白VP16的强激活结构域加入到调控质粒中,增强了Gal 4-ER的转录激活能力,并且消除了由于细胞系不同而导致的背景差异,同时构建了由4个Gal 4结合位点、小鼠Ⅱ型主要组织相容复合物的CCAAT盒、来自腺病毒晚期转录单位(—39～+15)的起始区和TATA盒组成的低背景、高响应的Gal4响应启动子序列调控下的c-fos表达载体。将该表达载体短暂转染NIH3T3和P19细胞系,培养基中加入雌激素,Gal 4-ER-VP16导致的响应启动子的活性提高了100倍。在整合有调控质粒与响应质粒的大鼠成纤维细胞中加入雌激素1 h～2 h后,fos表达水平开始升高,并导致了该细胞系依赖雌激素的转化。

为了在果蝇胚胎后发育阶段在幼虫神经肌肉接头表达转基因,Osterwalder T等[15]成功的建立了基于Gal4的条件性组织特异转基因表达系统。首先,选择了神经特异表达的胚胎致死异常视力样基因(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)的启动子和肌肉特异表达的肌球蛋白重链基因(myosin heavy chain,MHC)的启动子,建立组织特异性(突触前或突触后)表达基因开关(RU486依赖的孕激素受体-Gal4融合蛋白,GeneSwitch)的果蝇,并和表达UAS转基因的果蝇交配,RU486可以开启或关闭目的基因的转录及表达。将一定剂量的GeneS-witch激活剂-RU486混在食物中饲喂,或者经“幼虫浴”(将第3龄期幼虫置于一定浓度RU486环境下一定时间),GeneSwitch活化,UAS转基因在突触前后在一定的时间条件下得到表达。在表达状态下,如果将果蝇移入无RU486的条件下,GeneS-witch介导的转基因表达将关闭。在幼虫发育的大部分时期,在激活剂不存在的情况下,UAS转基因背景转录水平非常低。

Asakawa K等[16]利用T ol2转座子,设计了GAL4基因陷阱方法,在转基因斑马鱼的特定细胞表达Gal4。将Gal4转基因鱼和UAS-报告基因和效应基因转基因鱼杂交,使详细分析斑马鱼基因在特定的细胞表达成为可行。

3 基于小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的时空调控系统

在ES细胞未分化状态下,干扰素(interferon)依赖的诱导系统能够开启/关闭氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)的表达,但IFN-β持续刺激ES细胞,非常可能影响其正常发育[17]。Zhang Y等[18]应用三苯氧胺(tamaoxifen)调控下的Cre重组酶(Cre recombinase)导致的Cre的重组,激活稳定整合在ES细胞的β-半乳糖苷酶(LacZ),但三苯氧胺的用量远远超出了细胞生长与小鼠妊娠的中毒剂量,并且存在有持续的LacZ的背景表达。

Vallier L等[19]将Cre重组酶与突变的雌激素受体融合,构建了对4′-羟基三苯氧胺(4′OH-tamoxifen,4′OHT)高度敏感的调控质粒,同时还构建了受Cre重组酶调控,由内源性启动子调控下的人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)转基因表达载体。经过药物筛选(G418、潮霉素),整合有调控质粒和响应质粒的ES细胞在分化及未分化状态下,在体内或体外,在非毒性4′-OH T的严格控制下均能表达转基因hAP。

4 基于RNAi的时空调控系统

近年来,做为在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因表达的一种重要手段,应用RNAi技术建立可调控的转基因动物模型方面的探索已经取得了很好的进展[20]。Higuchi M等[21]利用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子H1在AGS细胞系表达酪氨酸磷酸酶2(Src homology phosphatase-2,SHP-2),建立了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(the lactose analogisopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside,IPTG)诱导的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达系统,SHP-2的表达受到调控。Wu R H等[22]建立的可诱导的siRNA表达系统能够有效、有条件的调控基因的表达,在非诱导条件下,背景效应很低,在短暂转染和稳定细胞系,荧光素酶和P53的表达被条件性调控。

Kotnik K等[23]构建了靶向胰岛素受体(insulin receptor,IR),四环素诱导短发夹RNA(short hairpin,shRNA)表达的转基因基因抑制(knockdown)大鼠,强力霉素可以广泛性抑制IR的表达及其信号通路,导致可逆的剂量依赖性的血糖增加,成功建立了可诱导的糖尿病大鼠模型。基于同样的技术原理,Herold M J等[24-25]也分别成功构建了可诱导的转基因大鼠和小鼠模型。

5 结语

在多种模式动物成功建立转基因表达时空调控系统的同时,对诱导药物的使用剂量、转基因的基础表达水平的掌握等方面还需要进一步的深入研究。随着诸多基因功能背景的逐步澄清及一些相关技术的发展,在选择最佳的模式动物,运用精细的技术手段,精确、严格的时空调控转基因表达的研究领域,必将有更大的突破,并广泛应用于生命科学研究。

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