高寒地区冬小麦抗寒育种研究进展

李卓夫，付连双，王晓楠，孙艳丽，佟明耀

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

高寒地区冬季严酷的条件，造成冬小麦植株死亡，使单位面积上植株数目不足而严重减产，甚至全部植株冻死而使冬小麦绝产。在高寒地区开展冬小麦育种，提高冬小麦品种的抗寒性，培育有效分蘖力强的品种，可以部分或全部弥补冬季冻害的损失，在高寒地区种植冬小麦才有可能。经过严冬后，如果高寒地区冬小麦能够全部存活，就可以形成较多的主穗，使得穗粒数和千粒重增加，有利于提高冬小麦的产量潜力。

冬小麦育种实践反复证明，采用广泛的冬小麦抗寒种质资源，用多种育种技术创造抗寒性遗传变异，经过高寒条件下严格的定向选择，就可以大幅度提高冬小麦的抗寒性水平。如美国的Hume，加拿大的Norstar、Kharkov22MC，前苏联的Alabaskaja、Ulianovkia均表现出稳定的抗寒性[1]；在黑龙江省，东北农业大学的小麦育种专家用3个强冬性的冬小麦品种杂交育成的“东农冬麦l号”，将冬小麦的种植范围北延至黑龙江省饶河县（北纬47°左右）[2]。

冬小麦经历严冬后，翌年是否可以继续存活的关键在于分蘖节是否安全越冬。国内外大多以冬小麦分蘖节的临界致死温度（LT50）作为冬小麦抗寒水平指标[1]。分蘖节是冬小麦植株地下部未伸长的节间、节和腋芽紧缩在一起的节群，具有再生性。在高寒地区冬季，冬小麦地上部位叶片将全部被冻死。只要分蘖节没有受到损害，翌年春天从分蘖节部位发出新根，植株入冬前所形成的分蘖就可以继续生长，地上部就可再长出新叶，即可达到生产上所谓的“返青”。随着分子生物学研究的发展，目前，在冬小麦抗寒性的遗传基础方面的研究已经获得了大量的证据，总结这方面的研究成果，将有助于提高冬小麦抗寒育种的成效。

1 高寒地区冬小麦冬季致死的原因

①小麦冬季致死的原因以及受伤害的程度，在地区之间及不同年份间变化很大。冬季致死的主要因素（单一的或联合的）均与低温本身有关（如极端的气温和土壤温度，低于某一特定小麦品种所能忍耐的临界温度），包括：秋季出苗晚，或温度突然降低；长时期冷冻引起组织干化[3]；0℃以下低温持续时间过长；特别是在隆冬，气温低于-15℃，可使冬小麦冬季耐寒力快速丧失[4-6]；冷冻与融化交替出现，每次冷冻引起冰晶生长造成伤害[7]。

②冰盖封闭也会导致冬麦致死，这是降雨、冬季温度波动大的地区植株死亡的主要原因[8]。冰导热性好，能加重低温对植株的伤害；冰透气性差，极端情况下植株由于吸不到氧气而窒息死亡[9-10]。

③春天出现严重的倒春寒也会对冬小麦的叶或穗造成伤害。未经低温锻练的叶片只可以忍耐-4～-8 ℃的低温[11]。

④低温和雪还能引起间接伤害，如，冻拔现象，由于土壤中结冰，土体隆起，将植株推向地表，拉断冬小麦的根，并使冬小麦的分蘖节及根暴露在地表以外，使冬小麦越冬主要部位失去土壤保护而死亡；在雪覆盖时间较长的地区不会发生真菌性病害-雪腐病。对冬小麦冬季存活伤害最大的真菌是粉红雪腐病菌（Microdochium nivale（Fries）Samuel and Hallet），以前称为（Fusarium nivale（Fries）Ces.）。虽然粉红雪腐病菌不能在冷冻条件下存活，但却能忍受低温，在0～5℃温度范围内对植株造成严重伤害。其他造成雪腐病的不太重要的真菌是灰色雪腐病菌（Typhula spp.），引起斑点状雪腐病或腐烂病，以及菌核雪腐病（Sclerotinia borealis），引起雪腐病。

引起冬季致死的各逆境因素，其相对重要程度在地区间存在很大差异。在乌克兰，长达100年的资料分析表明，由低温造成的冬季死亡占总死亡比例的35%，由交替冻融引起的占26%，由冰盖封冻引起的占22%[10]。在波兰，影响冬小麦冬季存活的主要因素有低温，冻干和病原真菌的感染[12]。在北美大平原，引起冬小麦冬季死亡的主要因素为长期低温冻干，秋季冷驯化不充分和无法预测的极限低温的时间和持续期。在加拿大西部冬季死亡的最初原因是冻干[3]。Olien发现，冬季死亡最可能发生在“倒春寒”的低温胁迫下，此时冬小麦植株开始萌发，根茎组织含水量高，抗寒力已经降低[13]。正确估计某一地区影响冬季存活主要因素的出现频率，是育种中决定亲本选择与抗寒性测定程序的基础，也有利于改进资源分配效率。

2 冬小麦耐寒性的诱导与保持

小麦植株可以通过不同的遗传与生理机制应对上述冬季胁迫中的任何一种。例如，植株耐冻性与抗雪腐病性的遗传机制就不同。然而，在引起冬季死亡的大多数事件中，基本过程是冷冻，即植株组织中冰晶形成。冷冻伤害一般不是低温本身的结果，而是由细胞脱水造成的，常发生细胞外结冰[1]。细胞膜被认为是冷冻伤害的最初部位[14]。Mizuno等发现，在低温驯化期和冷冻期，小麦线粒体基因变化也对抗寒性有较大影响[15]。

耐冻性被定义为植株在细胞外组织结冰，没有对膜或其他细胞器造成显著伤害情况下而存活。这是生理、生物化学和物理反应的结果，也是在较适宜的环境条件下，适当发育阶段所发生的植物细胞结构变化的结果[16-18]，这个过程称为低温锻炼或低温驯化[11,19]。

低温驯化由2个阶段组成，冷凉（＞0℃）温度下的应答和冰冻（-3～-5℃）温度下的应答。在植物驯化的第1阶段所表现出来的特性是在液泡中糖分积累，组织渗透势降低而引起的组织水势的降低。这与脱落酸水平显著增加有关，并导致蛋白质合成的修饰。谷类作物间在0℃以上驯化开始的温度差异很大。冬黑麦开始的温度较高，因此，其低温驯化期长于冬小麦。春小麦和春大麦在2℃以上温度驯化不能开始[3]。膜特性的可逆修饰性可导致薄壁细胞组织进一步水势下降，似乎在由霜冻引起的驯化中发挥重要作用[20]。低温作为最初的诱导因素起作用，而其他因素（水分胁迫，风等）也会引起冷冻耐性达到某个水平。低温本身或次级因素（ABA、葡萄糖、脂肪酸、水分状态），都会对初始信号产生应答，导致在膜上、蛋白质、ABA激素受体产生结构变化，反过来调控冷驯化中基因的表达[3]。有几个基因已经在不同植物中被鉴定出来，有低温诱导型（Low temperature induction，LTI）和冷调控型（Cold regulation，COR）。这些基因表达可对细胞膜起保护作用[21]。与霜敏感基因型比较，抗霜冻品种冷驯化进行得较快，而脱驯化则较慢，建议不同耐冻水平的品种，驯化应有不同诱导温度阈值。大麦中，抗冷冻品种的诱导驯化温度较高，可积累COR蛋白质[22]。

品种耐冻性并不固定，随着时间、温度、土壤含水量、植株含水量、营养状况、生理阶段及状态而变化。在很大程度上依赖于冷驯化或锻炼过程[23-26]。实际上，不同品种间未经锻炼的植株间耐冻性差异可以忽略，而在充分锻炼后，才能显示出品种间差异。锻炼过程可以被终止、逆转、重新开始。一般在自然条件下，耐冻性的动态特性表现为3个阶段[27]：阶段1，秋季的锻炼时期，经此期冬小麦获得耐冻性；阶段2，耐性保持期，在此期内，临界温度或致死温度发生变化，这依赖于冬季温度波动情况；阶段3，耐性丧失期，通常在冬季结束时，植株失去了耐冻性。

上述每个阶段不仅受基因型影响（包括春化要求、光周期反应）或发育阶段因素影响（包括株龄），而且还受环境因素影响[28-30]。例如，如果土壤含水量过多或过少，冬性谷物的冷驯化效果就会有极大的变化[31]。同样的，0℃以下低温时间过长，会使冬小麦苗耐冻性大幅度下降。有试验表明，冬小麦充分锻炼后，植株越冬部位最强耐冻性在-15℃下仅能忍耐6 d，在-18℃下仅能存活24 h，在-23℃下仅能存活12 h[32]。幼苗的越冬部位在低温下暴露时间过长，所获得的耐冻性就会大幅度降低，可在比初冬时高得多的温度下被冻死。所以，高寒地区冬小麦分蘖节在土壤中的位置对于冬小麦越冬返青率影响至关重要。

初冬耐冻水平相同的品种间在应对长时间冷冻温度的能力上差异相当大。冷冻低温的持续期与低温强度是确定冬小麦耐冻性丧失及随后的冬季死亡的主要因素。植株耐冻性还受植株营养状况[33]、除草剂[34]、病毒感染[35]及种子带病原[36]，如散黑穗病（Tilletia foetida and T.caries）的影响。这就是要检测基因在耐冻性上的差异，必须严格控制环境条件尽可能一致的原因[37]。

3 冬小麦抗寒性的遗传基础

耐寒性是许多细胞及植株性状中复杂生理机制综合表达的结果[38-41]。大量研究表明，耐冻性的遗传控制是复杂的，涉及多基因。在影响对低温耐性上，小麦21条染色体中有15条与之有关[42]。Monroy等的试验则发现，在冬小麦冷驯化过程中，有至少450个基因在转录水平上发生了变化[43]。Skinner在用抗寒性不同的品种进行试验时，在低温驯化期间及驯化后，发现有423个基因的表达水平发生了显著的变化，其中，有68个基因在冷冻处理中上调表达量高达至少5倍；而在这68个基因中，有17个属于编码CBF、WRKT及锌指蛋白的，表明这17个上调表达的基因主要在转录调控上发挥作用；另外，这68个基因中有16个编码细胞分裂素、磷酸化酶、Ca传递蛋白或葡萄糖基转移酶，说明这些基因在信号传导中发挥作用；还有6个上调基因编码叶绿素a/b结合蛋白，表明其作用主要是在低温下保护色素分子[44]。有的主基因对低温应答有较大影响[45]，如控制光周期反应基因（Fr）与控制春化反应的基因（Vrm），其中Fr1在5A染色体上，与Vrn1基因紧密连锁，但可以重组；Fr2在5D染色体上，与Vrn3连锁，也容易分开。耐冻性与春化要求有关，这可以部分的由控制耐冻性的主基因与2个控制生长习性的基因连锁关系上得到解释。另外，春化基因作为关键的发育因素已经被鉴定对低温诱导结构基因表达的持续期有应答反应[46]。最近数据显示，在转录水平上发生了低温诱导结构基因表达过程中春化基因对调控过程施加的影响[47]。

与春小麦相比，冬小麦开始低温驯化的温度高，春小麦的低温锻炼仅能达到非常有限的程度。同样，在春季，完全春化后的冬小麦经重新低温锻炼仅能达到春性谷类作物的水平。很明显，高水平的耐冻性仅能在“休眠”的，不能快速发育的植株上获得；因此，冬性谷物幼苗所获得的春化程度与耐冻性程度间存在着很强的关联[24]。而在北欧，春化时间极长的冬小麦品种却在耐冻性上仅达中级水平[3]。Braun发现，生长习性与耐冻性间存在高度显著相关（r=0.67～0.77），这可以解释 45%～60%的耐冻性变异是由春化要求差异造成的[48]。

已经发现，耐冻性与匍匐生长习性有关。1个控制匍匐生长习性的基因与5A染色体上的Fr1和Vrn1基因紧密连锁[25]。遗传连锁也许还不能解释所观察到的关联，因为，匍匐生长植株很少暴露在低温和干燥条件下，可以被雪很好地保护。值得提起的是匍匐生长类型，在秋季休眠的幼小植株上常可见到，也能出现在春化要求较低但对光周期反应要求高的品种上。小麦中，这样的品种通常仅有中等耐冻性，但在大麦上，最耐冻的品种中有些就属于对光长敏感，而对春化要求较低的类型。

春化要求高且光长反应要求也高的，以及引起冬季休眠的其他机制，使植株进入生殖生长阶段（分生组织分化）延迟，一般均与晚熟性有关。在一个冬燕麦的试验中，所选择的较高水平耐冻性也表现较晚熟特性，还常比理想株高更高[49]。类似的关联也可在小麦上观察到。这种关联性使得培育早熟、矮秆、抗寒的冬小麦品种更为困难。然而，通过比较来自于品种Yogo的冬小麦株高等基因系时发现，仅以株高进行耐寒性选择无效[50]。这说明耐寒性与株高间的关联可能依赖于所具有的株高基因数量及遗传背景。

4 冬小麦抗寒育种技术

在育种程序中，操纵类似耐寒性这样的复杂性状是一个很困难的任务，因为涉及的基因数量大，与环境间互作关系多[5,42]。但培育耐冻性小麦的主要困难却在于普遍存在的耐冻性常与低产和晚熟相关联。

许多与耐冻性有关的性状，如春季生长晚，或细胞小，对产量均有负向作用，特别是在早春降雨环境下快速生长以及早熟性对避免后期干旱和高温很重要时，冬小麦育种的难度更大。除此之外，其他一些育种目标将使所有感兴趣的性状遗传进展减慢。因此，育种目标不应该是使耐寒性达到最强，而应培育出在某一具体地区耐冻性水平够用的最低限的品种。正如Fowler等指出，一般来说，最成功的冬小麦品种仅有比种植区域所要求的最低耐寒性略高一些的耐寒水平[51]。确定某个地区所需最低水平耐寒性并不是一个简单的工作[52-53]。应以估计冬季死亡风险为基础，既要有气象数据，又要有在本地区品种表现的信息。对历史气象数据进行仔细分析，包括最低温度及出现的时间与频率，是有用的，但并不充分。同样低温对于小麦植株可能有相当不同的影响，这依赖于低温出现前的温度格局及其他因素，这样才能确定应获得的耐寒性水平。有些作物模型，如CERES，也可用来模拟耐寒性及冬季死亡，可用于估计冬季死亡的风险。

一种较简单，但非常有用的方法，是用在耐寒性水平上有差异的品种在相应地区做长期冬季死亡试验及越冬性试验记录而获得的数据[54-55]。一般在一个地区多年种植一个品种，通过其所表现的偶然但不很严重的冬季死亡来判断该品种的耐寒性水平并不困难。通常在10年中有1年出现一定程度冬季死亡的频率是可接受的。可接受的风险可以高些或低些，这依赖于经济、社会及其他因素。如果能鉴定出这样一个品种，就可作为在本地区所需最低耐寒性水平最好的标准。在所有耐性试验中必须要有对照，以用于提供耐性水平的变化范围。当较高耐寒水平的小麦品种种植在冬季风险较低的地区时，在没有冻害的年份，其产量损失可能会大于在严酷冬季年份较高越冬成活植株所增加的产量。

培育耐寒性的育种策略将依赖于所用基因库中抗性水平的比率及目标地区所需最低耐冻性水平。如果杂交中所用亲本大多具有与所需耐冻水平相等或更高时，保持这个水平就相对容易，通过应用中等选择压力，淘汰不耐寒的后代就可达到目的。相反，所用的亲本抗寒性不够强，如春性×冬性，建议选择压力要大，早代就要对抗寒性进行选择，以便恢复到所需耐寒性的水平。早代选择，淘汰春性的类型，可能是非常有效的[56-58]。耐寒性育种在冬小麦种植边缘地区可能更加困难，所要求的耐寒性水平更高。Grafius指出，在本世纪还存在着谷类最大耐寒潜力改良的空白地带。植物育种家在提高最大耐寒性上表现不够充分，应开发曾在过去种植过的冬性谷类作物中耐寒的地方品种所聚集的所有抗寒基因。在高产基因型中恢复这种最强耐寒性，只有在大的分离群体中应用非常高的选择压力才有可能达到要求[59]。

引入的耐冻基因在后代中分离的现象，仅出现在中等抗性水平或有不抗寒亲本的杂交组合中，而在最抗寒的亲本组合中多不出现。采用种间杂交，从其他物种（如黑麦）引入新抗寒基因有望进一步提高小麦抗寒性，但目前还没有在普通小麦中成功的先例。许多科学家曾尝试过避免直接冷冻植株，因为，冷冻室费用高，试验误差大。建议采用间接测试方法来估计耐性水平，取代冷冻试验。植株含水量在锻炼期下降，特别是耐寒的基因型更加明显。发现锻炼后含水量与冬季存活能力相关[51]。

脯氨酸也被认为当植株遭受多种胁迫时，包括霜冻，有保护作用。冷驯化阶段在叶片和苗中积累大量的自由脯氨酸，脯氨酸积累量与基因型专化耐霜性呈正相关[60]。锻炼后测定脯氨酸含量能提供有关品种潜在耐冻性的信息。在耐冻水平与特殊冷调节（COR）小麦蛋白（WCS120）间存在紧密相关性。这种应答抗体可鉴别耐霜与霜敏感小麦品种[61]。因此，这种蛋白质可用作选择耐冻性的一个分子标记[57]。8天龄小麦苗的组织电阻被发现与耐冻性相关。这是一种育种计划中非常方便适用的选择工具，并可实现利用人工气候室加代[17,62]。限制性片段长度多态性（RFLP）及其他分子标记也可用于鉴定耐寒性有正向作用等位基因的存在。间接方法虽然非常吸引人，但通常仅能描述在控制基因型耐冻性差异的某些机制，因此或许仅能开发育种中有用的部分遗传潜力。此外，这些方法通常花费太贵，因此，只局限于较深入的研究项目。

5 展 望

自从本世纪初在高寒地区种植冬小麦品种Minhardi以来，提高对低温胁迫抗性的育种进展很小[59]。然而，这种理论涉及到小麦植株能存活的绝对最低温度。世界上冬小麦种植区域中大多数不需要小麦品种具有这么高水平耐寒性。结果，许多冬小麦育种计划中的主要育种目标没有关注冬小麦生产中所用品种的耐寒水平的丢失，这使冬小麦品种的耐寒性丧失程度更大。

冬小麦的耐寒性一般要通过创造大量遗传变异，并在常规田间条件下筛选来提高。越冬后田间存活率测定目前仍然是大多数冬小麦育种计划中标准操作规程。在人工控制环境下或用其他间接方法测定冬小麦的抗寒水平，由于其成本过高，还难于在育种实践中加以应用。鉴定控制抗寒基因，开发分子标记，将会克服一些在田间试验和/或控制环境选择中存在的部分问题。然而，田间试验还将保留相当长时间，直到最终冬小麦品种的耐寒性能用其他更为方便准确的方法测量。

要提高小麦耐寒性育种效率，应在品种要推广区域，依据温度波动，雪覆盖度，病害等方面的长期观测数据，确定使冬小麦冬季死亡的各逆境因素的先后顺序，以明确育种鉴定中应考虑的主要逆境因子及水平，建议从以下几个方面考虑：

①由于冬小麦耐寒性水平与品种生产力水平（如产量）存在一定程度的负相关，因此，应估计相应种植区冬小麦品种所需的最低耐寒水平，将冬季受冻害水平降至可接受水平，即品种的越冬返青率在70%左右时，其产量等水平可以不断提高。

②建立一套对照品种，代表假定最大与最小冬季死亡风险，以供本地区育种长期种植，作为育种后代鉴定选择的标准。

③利用各种机会在田间选择，减少冬季不耐寒品系出现的机率。

④改进人工冷冻操作程序，使之适应现有仪器及潜能。将种植、锻炼、冷冻、恢复生长等过程标准化，以提高可重复性。

⑤建立一个耐寒亲本与高代品系的数据库。在冬小麦耐寒育种的杂交组合中，不能缺少耐寒性理想的材料作亲本。

*本文为特邀综述。

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