转录后基因沉默与植物抗病毒研究进展

朱春晖，张德咏，刘勇

（1.中南大学隆平分院，湖南长沙，410125；2.湖南省植物保护研究所）

转录后基因沉默与植物抗病毒研究进展

朱春晖1，张德咏2，刘勇2

（1.中南大学隆平分院，湖南长沙，410125；2.湖南省植物保护研究所）

主要综述了转录后基因沉默（PTGS）的发现、定义、机制、与植物抗病毒的关系及利用转录后基因沉默防治植物病毒病研究进展。

转录后基因沉默；dsRNA；抗病毒

病毒病是农作物的主要病害之一，素有植物“癌症”之称，难以防治，给农业生产造成了严重损失。据不完全统计，全世界每年因植物病毒病所造成的产量损失约占粮食总产量的10%[1]。许多重要病毒已遍及我国农作物的主要产区，对许多作物造成了不同程度的为害，严重影响着这些作物的产量和品质。

目前生产上病毒病防治常用的方法有农具、土壤消毒，使用农药驱除或杀死昆虫介体，组织脱毒法获得无病毒繁殖材料及用传统育种方法引入抗性基因等[2]。这些方法都有不同程度的弊端，例如喷施农药不仅价格高，而且造成严重的环境污染；组织脱毒法成本高、工作量大、有效期短；抗病育种存在资源贫乏，抗病基因和劣质性状基因连锁、周期长、抗性基因遗传不稳定以及不能解决某些品种间的远缘杂交等困难。从20世纪80年代初植物基因工程问世以来，科学家们就一直探索用基因工程的办法来改良作物的抗病毒特性。将病毒基因组上基因的cDNA转化到其他植物获取抗病毒植株是当前防治病毒病的重要途径[3]。即应用来源于病原的抗性 （pathogen-derived resistance），现在已经有转病毒的CP、MP等基因成功的例子[4]。但使用这种方法获得高抗转基因植物的几率较小，因而寻找一种更高效、经济的获取抗病毒转基因植株的方法已是当务之急，而植物RNA沉默机制的揭示为我们提供了新的防治植物病毒病害的前景[3]。

1 转录后基因沉默 （post-transcriptional gene silencing，PTGS）的发现及定义

基因沉默（Gene silencing）[5]是指生物体中特定的基因由于种种原因不表达，主要发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默 （transcriptional gene silencing，TGS），另一种是转录后基因沉默（PTGS）。PTGS是指转基因在细胞核里能稳定转录，细胞质里却无相应的稳定的mRNA存在的现象，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活。基因沉默首先在转苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）基因的矮牵牛（Petunia）中发现[6]，后来在其他生物中都有关于基因沉默的报道。不同领域的研究者给它作了不同的命名：植物学家称之为共抑制（co-suppression）或转录后基因沉默（PTGS）[7～8]；线虫和果蝇的研究者称之为RNA干扰（RNAi）[9]；真菌研究者称之为消除作用（quelling）[10～11]。这些现象其实都是由同源的转基因、RNA病毒和双链RNA等诱导产生的一种特定序列的RNA降解机制。进一步的研究发现双链RNA（dsRNA）能够高效地诱导该机制的起始[12]，随后它被一种核酶（RNaseⅢ）切割成21~25 nt的小的干扰RNA（siRNA）[13],其中21~23 nt的siRNA与RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，共同作为引导物去选择目标RNA并对它进行降解。植物中RNA沉默的最显著特征是它是一种非细胞自发的过程，能够局部诱导，随后通过一种可移动的信号分子扩散至整个植物组织[9,14]。其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵、识别并抑制外源基因的表达，具有维持生物基因组稳定性的重要功能[15]。

病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是由植物病毒载体感染植物引起的并启动相应的寄主中RNA沉默的现象[16]。病毒诱导基因沉默能有效地抑制与内源基因相关的一些生物合成途径。病毒诱导基因沉默不仅是研究基因沉默机制的热点，而且还是研究植物抗病防御和植物基因功能的一种有效手段。病毒诱导基因沉默是由RNA介导植物抗病防卫机制（RNA-Mediated Defense，RMD）和一个相关的转录后基因沉默机制（PTGS）引起的。已经证明，病毒诱导基因沉默是植物抗病的可能机制[17]。

2 PTGS的机制

PTGS是一个很复杂的过程，目前其机制还没有统一[18]。从PTGS应用的不同系统和不同的角度研究，人们先后提出了一系列的假说[19]。但其过程主要分为3步：起始、维持和传导。目前对PTGS的诱发机制的解释有3种模型，即RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型[20]。在这一系列模型中RNA起着非常重要的作用，它不仅是PTGS现象的启动因子，同时也是PTGS作用的靶分子[21]。不论何种诱发因素，所导致的RNA沉默最后都汇集到dsRNA产生后对同源性较高的目标基因的mRNA降解这一过程上。

2.1 RNA阈值模型（RNA threshold model）

该模型认为，由于激发了外源基因的高水平转录，以至于积累到某个阈值，从而启动了降解特定mRNA的反应，造成转录后水平上的基因沉默[22]。

2.2 异常RNA模型（aberrant RNA model）

这一模型认为转基因mRNA的异常结构激活了PTGS。Dougherty等[23]认为在植物的细胞质中存在一种依赖于RNA的RNA合成酶（RdRp），能以mRNA为模板合成小片段的cRNA，cRNA与mRNA杂交，从而成为专一性作用于双链RNA的RNA降解酶的底物，提出了RdRp-cRNA模型。已从番茄中发现了RdRp，体外试验证明该酶能以RNA为模板合成cRNA[24]，在体内这些cRNA杂合到相应的mRNA上，被特异作用于双链RNA的RNA降解酶降解。

2.3 双链RNA模型

前面叙述的2种模型都着重于PTGS的起始，而随着对参与PTGS的细胞成分及相关基因的深入研究，人们对PTGS作用机制有了更为详尽的了解，现在普遍认可的机制是在上述2种模型的基础上由Waterhouse等[25]提出的dsRNA模型 。

①dsRNA对RNA沉默机制的启动 随着PTGS的发现，许多理论都试图去解释RNA沉默的机制以及该机制的诱导因素[26～27]。现在普遍接受的观点是dsRNA是RNA沉默的有效诱导因子，该机制通过降解特定序列的RNA发挥作用。通过使用以RNA病毒和转基因为目标的转基因系统，该机制首次在植物中得到了证实。Waterhouse等[28]发现单独表达正义或反义的马铃薯Y病毒（PVY）蛋白酶（Pro）基因的转基因烟草对PVY没有抗性，但是同时表达正义和反义的PVY Pro基因的杂交烟草植株则对其产生免疫；与此相类似的是表达自我互补（hairpin）的GUS转基因在沉默GUS基因方面，其效率也远远高于单独转正义或反义的GUS转基因；烟草中79 nt的反向重复ACC氧化酶序列可以有效地抑制ACC氧化酶的表达[29]。这一结果进一步证明，dsRNA是基因沉默的有效的诱导因子。在矮牵牛中也存在着CHS基因的沉默和相同基因的两个或更多个转基因拷贝的反向重复插入的联系[30]。这种转基因的插入方式可以通读转录产生dsRNA[31]。不同情况下启动RNA沉默的dsRNA来源不同，转基因诱导的RNA沉默其dsRNA可以由转基因的反向重复序列转录产生，也可以将目标基因的正义链和反义链同时转入植物中杂交产生[28]，还可以通过RdRp将转基因的异常转录产物转变而成[32～33]；RNA病毒诱导的RNA沉默的dsRNA几乎都来源于病毒复制的中间体[34]，少数像黄瓜花叶病毒（CMV），马铃薯X病毒（PVX）等病毒，它们复制中的dsRNA可以来自该病毒产生的异常RNA[35]；RNAi中的dsRNA则是来源于体外注射dsRNA等[9]。dsRNA在由单拷贝转基因所引起的RNA沉默中的作用还未知，但是很可能某些转基因，如CHS基因和Nii基因，当它们的RNA足够多时，在它们的编码区含有能诱导沉默的dsRNA结构[34]，另一种可能性是植物编码的RdRp，把单链RNA作为模板去合成能诱导沉默的dsRNA[32～33]。至于DNA病毒，确实很难想象它的dsRNA是如何产生的。不过在它的基因组的复制和转录时确实偶尔有dsRNA生成，现在人们推测DNA病毒诱导RNA沉默的原因有3种情况：一种是DNA病毒的复制能力和高转录水平能够导致dsRNA分子的积累；另一种是dsRNA分子中以ssRNA为模板，通过寄主的RdRp合成的；第三种可能性就是在DNA病毒侵染的细胞中，诱导RNA沉默的因子本身就不是dsRNA分子。又有研究发现，dsRNA在植物中能诱导特定序列的DNA甲基化[36～37]，从而促进异常RNA产生，进一步来强化PTGS。

②dsRNA降解成21~23 nt RNA Hamilton等[38]和Elbashir等[33]发现，有等量的正义链和反义链21~23 nt RNA存在于发生RNA沉默的植物和动物中。这暗示着，诱导RNA沉默的dsRNA很可能是这些小分子的前体物质。后来，Bernstein等[39]从果蝇（Drosophila）中分离到了一个RNase III的蛋白酶-Dicer，它能够在体外把dsRNA降解成21~23 nt RNA[40]，21~23 nt RNA能够特异性地攻击目标RNA。Dicer的缺失突变会减弱果蝇引发RNAi的能力，说明Dicer是催化切割dsRNA形成小分子RNA的一个关键酶，而Dicer的发现有力地支持了dsRNA确实是在Dicer的催化下降解成小分子RNA。

③21~23 nt RNA是RNA沉默的特异性决定因子在转基因植物发生RNA沉默时，发现有一种低分子量的反义RNA的持续积累，这种RNA与目标mRNA序列具有高度同源性[38]。类似大小的RNA分子也在动物执行RNAi中检测到[41～42]，它们是与一种核酸酶一起被分离的，并且这种核酸酶是一种由多个亚基组成的复合体，即RNA诱导的沉默复合体（RISC）[13]，低分子量的RNA是和RISC结合在一起的，它首先在果蝇S2细胞中被分离到。最近的研究表明，在果蝇中，21~23 nt RNA分子对于RISC诱导的同源、单链RNA分子的降解是必要的，并且也足够诱导其发生降解[43]。低分子量的RNA在RISC复合物中能够特异性地识别ss-RNA序列。这些都表明21~23 nt RNA可能是RNA沉默的特异性决定因子。

3 PTGS是植物自然的抗病毒机制

PTGS是植物在长期进化的过程中形成的一种抵御外来病毒的防卫机制。因为：①在转病毒基因的转基因植物中，病毒是RNA沉默降解的靶标；②在转基因植物和非转基因植物内，病毒能诱导RNA沉默；③交叉保护试验中由于诱导病毒产生的RNA沉默，而使植物对含有与之高度同源核酸序列的相近病毒的侵染具有抗病功能；④病毒表达特异的蛋白能抑制RNA沉默；⑤沉默信号的存在，也意味着RNA沉默是植物的抗病机制。在侵染细胞中产生的RNA沉默向侵染部位的前方传导，因此，非侵染细胞接受信号后能激活自身的抗病反应，使植物系统抗病。证明病毒诱导基因沉默与植物抗病有关的 3个经典试验：①RNA病毒介导 RMD （RNA Mediated Defence，RMD）。Ratcliff等人[45]利用线虫传花叶病毒属中的番茄黑环病毒接种烟草（Nicotianasp.），该病毒携带与寄主植物基因序列相似的一段片段，可以诱导烟草后期出现同源依赖的抗病毒抗性。结果表明，抑制或预防病毒感染的植物体内抗性机制是存在的[46]。②DNA病毒介导RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Al-Kaff等[47]人用花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）分别接种含有设计成与CaMV的DNA序列同源、部分同源或完全不同源3种的转基因油菜，结果与病毒同源的转基因在CaMV感染下被沉默。③基因沉默信号介导RMD（RNA Mediated Defence，RMD）。Hamilton等[48]人将带有水母绿色荧光蛋白（Jellyfish Greenfluorescent Protein，GFP）的转基因烟草 （Nicotiana benthamiana）浸泡在带有GFP报告基因的农杆菌菌液里，结果表明GFP转基因的表达是沉默的。进一步试验证明，GFP转基因沉默与GFP信使RNA水平降低有关。沉默是一种信号分子产生的，而且核酸是通过病毒或类病毒移动的渠道在植物中移动，阻止病毒扩散。Bosher等[49]研究反义RNA是基因沉默的信号，因为只要有足够的宿主编码的RNA指导下的RNA聚合酶的底物，反义RNA（antisense RNA，asRNA）就能被合成，如果相关mRNA的3＇端特定部分降解，就会导致转录后水平的基因沉默。

4 利用转录后基因沉默（PTGS）防治植物病毒病研究进展

自从1986年Beachy等将TMV的外壳蛋白（CP）基因导入烟草，在世界上首次获得了抗TMV感染的转基因植株，随后证明不但植物病毒的CP基因可在多种植物上产生不同程度的保护作用，病毒基因组上的其他基因，如复制酶（Rep）基因，移动蛋白（MP）基因等转化植物后也具有一定的抗性。目前，人们已将多种病毒来源的基因转入多种植物获得了多种抗病毒植株，有的已经进入了商品化生产，给农业生产带来了一定的经济效益及社会效益。然而，人们基本上还是将病毒基因组上某一基因的一段或全部基因的cDNA构建成正义或反义结构转入植物，所得抗病毒转基因植物的比例和抗性程度都不高。PTGS现象的发现为植物病毒病的防治提供了新的可能。PTGS是真核生物细胞对外源遗传因子的一种特异性的、高效率的降解机制，这种机制一旦被外源RNA分子所激活就能通过序列同源性的行为对任何胞质RNA进行降解[50]。自从首次在转基因矮牵牛中发现RNA沉默现象以来，已发现RNA沉默是生物界中普遍存在的现象，是与植物的抗病性密切相关的过程[51]。RNA沉默的最突出的特征是它可以局部诱导，并通过韧皮部系统[52～53]传播。尽管具体的沉默信号分子还未鉴定。但RNA降解过程的序列特定性表明，它很可能是一种核酸分子[35]。1998年Schiebel等[54]将PVY的Pro基因分别正向或反向转入烟草中，再对转基因烟草进行杂交，发现杂交后代含有正向或反向Pro基因的转基因烟草中，有约15%的植物对PVY产生抗性或免疫，而同时含有正向和反向Pro蛋白的转基因烟草，对PVY有免疫作用的植株就占转基因植株总数的44%~54%。他们推断很可能在同一植物细胞中同时含有正义和反义RNA（即dsRNA）是诱导烟草植株对PVY免疫的真正原因。这是在植物界中，最早发现病毒抗性能同时被表达正义和反义RNA诱导。这一发现把研究基因功能、沉默植物的内源基因以及抗病策略引向依靠同源的dsRNA诱导RNA沉默这一机制上。

随着研究的深入，已有研究发现植物中的RNA沉默能被编码dsRNA或自我互补的发夹RNA（hairpin RNA，hpRNA）所诱导[12，25，55]。人为设计这种类型的遗传结构，如将目标基因的一段或全部cDNA设计成含有自我互补RNA的反向重复结构，转入植物以后能转录产生hpRNA，启动植物体内的RNA沉默，从而降解hpRNA的双链区和与双链同源的内源的mRNA。利用dsRNA能诱导RNA沉默从而导致与dsRNA同源的内源基因的表达受到抑制已经有几例报道。2002年Stoutjesdijk等[56]报道了将拟南芥内源的Delta脱氢酶基因（FAD2）构建成hpRNA结构转化拟南芥菜。发现大约有75%的转hpRNA结构的植物，Delta脱氢酶的活性急剧下降。Liu等也通过了hpRNA介导的基因沉默技术产生了富含硬脂肪酸和油酸的棉籽油。而在利用dsRNA技术进行植物的抗病毒方面却很少有报道。

2000 年Wang等[12]将大麦黄矮病毒-PAV（BYDVPAV）的聚合酶基因（Polymerase）构建成hp BYDV结构转化大麦，有36%的转基因植株对BYDV-PAV具有免疫作用。2003年浙江大学的牛颜冰博士[57]以黄瓜花叶病毒（CMV）的Fny分离物的复制酶基因（△Rep）构建成具有反向重复序列的pBluescript SK-重组质粒转化烟草，有25/40的植株获得对CMV的抗性；以番茄花叶病毒（ToMV）运动蛋白基因（MP）构建成具有反向重复序列的pBluescript SK-重组质粒转化烟草，有23/47的植株获得了对TMV的抗性。而且研究发现瞬时表达或摩擦接种的dsRNA都能启动RNA沉默的起始，但保持则需要与目标RNA同源的细胞因子、转基因或内源基因。2003年Anastasia[58]等用来源于PVY的CP基因构建了能够表达dsRNA的植物表达载体，并转化马铃薯，有12/15的转基因的植株能够产生抗性，而且对PVY的三个株系均有高度抗性。

从2003年开始，西班牙的Tenllado在这方面做了比较多的系统的研究。首先他及他的同事把辣椒轻度斑驳病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）的54 kDa蛋白区域、烟草蚀纹病毒（TEV）的HC-Pro蛋白、及苜蓿花叶病毒（AMV）的各个RNA的cDNA克隆体体外转录产生dsRNA，将得到的dsRNA与同源病毒摩擦接种植物叶片，发现只有与该病毒具有极高序列同源性的dsRNA才能对侵染产生干扰作用。其抗病性分析还表明，产生干扰侵染作用对dsRNA的长度、浓度都有要求，而且植物中局部导入dsRNA不能诱发系统的抗病毒反应[59]。随后他们首次证实用含有能转录产生dsRNA的结构的农杆菌浸润接种非转基因植物叶片，所得dsRNA对植物病毒浸染具有干涉作用。并进一步证明dsRNA对目的病毒有特异抗性，证实了诱导沉默的都是RNaseIII切割dsRNA的siRNAs[60]。他们还利用缺失RNAase III的大肠杆菌HT115（DE3）菌株[61]初步建立了dsRNA的细菌生产体系和粗提取方法，研究了dsRNA粗提取物处理植物的喷洒技术，为促使细菌生产dsRNA抗病毒技术产业化应用作了一些预期工作[62]。

2006 年Zhao等[63]人根据TMV 126 kDa蛋白基因设计合成shRNA（short hairpin RNA），能有效的干扰TMV的侵染，此干扰是序列特异的，受时间和位点影响，而且必须是shRNA与TMV接种在同一叶片上，此结果开启对植物病毒在RNAi方面治疗性的新进展。

2008 年，张德咏等[64]构建了含有CMV同源基因的RNA2片段和MP基因反向重复片段的原核表达载体。利用大肠杆菌HT115（DE3）菌株中可表达产生目的dsRNA。用能够表达dsRNA的细菌超声波破碎后在温室中处理烟草进行保护和治疗试验，结果表明，两种表达dsRNA的细菌破碎液能够诱导烟草对CMV产生抗性，保护效果试验60 d后发病率分别为45%和60%，治疗效果试验60 d后发病率分别为75%和85%，而其他对照发病率均为100%。此结果为dsRNA的田间应用提供了研究参考。

[1]Fraser R.Plant resistance to viruses[M]//Encyclopedia of Virology (A Granoff and RG Webster,eds.)Academic Press, San Diego,California,1999:1 300-1 307.

[2]程海鹏，朱睦元，金伟，等.植物转基因沉默研究进展[J].生物工程进展，2001，21（6）：42-47.

[3]孟祥兵，王秀芳.基因沉默[J].生命的化学，2001，21（6）：111-114.

[4]Rob G,Etienne B,Marcel P.Resistance mechanisms to plant viruses:an overview[J].Virus Res,2003,92：207-212.

[5]郭兴启，朱常香，宋云枝.RNA沉默与植物病毒[J].生命科学，2002，14（1）：9-13.

[6]Napoli C,Lemieux C,Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous gene in trans[J]. Plant Cell,1990,2:279-289.

[7]Baulcombe D.Unwinding RNA silencing [J].Science, 2000,290:1 108-1 109.

[8]Matzke M,Matzke A,Pruss G,et al.RNA-based silencing strategies in plants[J].Cur Opin Genet Dev,2001,11:221-227.

[9]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391：806-811.

[10]Romano N,Macino G.Quelling:transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences[J].Mol Biol，1992,6:3 343-3 353.

[11]Cogoni C,Irelan J T,Schumacher M,et al.Transgene silencing of the al1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation[J].EMBO, 1996,15:3 153-3 163.

[12]Wang M B,David C A.Waterhouse P M.A single copy a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to Barley yellow dwart virus[J].Mol Plant Pathol, 2000,1：347-356.

[13]Hammond S M,Bernstein E,Beach D,et al.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404:293-296.

[14]Winston W M,Molodowitch C,Hunter C P.Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1[J].Science,2002,295:2456-2459.

[15]Ratcliff F G,Martin-Hernandez A M,Baulcombe D C.Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing[J].Plant J,2001,25：237-245.

[16]周晓馥，王兴智.病毒诱导基因沉默-植物抗病的可能机制[J].松辽学刊：自然科学版，2001（3）：5-16.

[17]刘征，李润植.转录后基因沉默与植物抗病毒防卫机制[J].植物生理学通讯，2001（37）：274-279.

[18]Kooter J M,Matxke M A,Meyer P.Listening to the silent gene：transgene silencing，gene regulation and pathogen control[J].Trends Plant Sci，1999，4：340-347.

[19]Agustin C,Giuseppe M.Characteristics of post-transcriptional gene silencing[J].EMBO,2001,2：992-996.

[20]段发平，梁承邺.转录后水平沉默与基因表达[J].生物学通报，2002（37）：15-16.

[21]Vaucheret H,Christophe B,Mathilde F.Post-trascritional gene silencing in plants[J].J Cell Sci，2001,114：3 083-3 091.

[22]Waterhouse P M,Grahrn M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95：13 959-13 964.

[23]Baulcombe D C,English J.Ectopic pairing of homologous DNA and post-transcriptional silencing in transgenic plants[J].Curr Opin Biotechnol,1996,7：173-180.

[24]刘杨，蒋彦，乔代蓉，等.转录后基因沉默的机制及其应用[J].生物工程学报，2002，18：140-143.

[25]Marx J.Interfering with gene expression [J].Science, 2000,288：1 370-1 372.

[26]Waterhouse P M,Smith N A,Wang M B.Virus resistance and gene silencing:killing the messenger[J].Trends Plant Sci,1999,4:452-457.

[27]Hamilton A J,Brown S,Han Y,et al.A transgene with Repeated DNA causes high frequency,post-transcriptional suppression of ACC-oxidase gene expression in tomato[J]. Plant J,1998,15:737-746.

[28]Meins F.RNA degradation and models for post-transcriptional gene silencing[J].Plant Mol Biol,2000,43:261-273.

[29]Stam M,Bruin R,Kenter S,et al.Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene Repeats[J].Plant J,1997,12:63-82.

[30]Dalmay T,Hamilton A,Rudd S,et al.An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus[J].Cell,2000,101:543-553.

[31]Ding S W.RNA silencing[J].Curr Opin Biotechnol, 2000,11：152-156.

[32].Mourrain P,Biclin C,Elmayan T,et al.Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for post-transcriptional gene silencing and natural virus resistance[J].Cell,2000,101: 533-542.

[33]Cogoni C,Macino G.Post-transcriptional gene silencing across kingdoms[J].Curr Opin Gen Dev,2000,10:638-643. [34]Voinnet O.RNA silencing as a plant immune system against virus[J].Trends Genet，2001，17:449-459.

[35]Mette M F,Aufsatz W,Winden J,et al.Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA[J].EMBO,2000,19:5 194-5 201.

[36]Sijen T,Vijn I,Rebocho A,et al.Transcriptional and post-transcriptional gene silencing are mechanistically related[J].Curr Biol,2001,11:436-440.

[37]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants [J].Science,1999,286:950-952.

[38]Elbashir S M,Lendeckel W,Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-22-nucleotide RNAs[J].Genes Dev, 2001,15:188-200.

[39]Bernstein E,Caudy A A,Hammond S M,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409:363-366.

[40]Parrish S,Fleenor J,Xu S,et al.Functional Anatomy of a dsRNA Trigger Differential Requirement for the Two Trig-ger Strands in RNA Interference[J].Mol Cell,2000,6: 1 077-1 087.

[41]Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,et al.RNAiDouble-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals[J].Cell,2000,101: 25-33.

[42]Elbashir S M,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411:494-498.

[43]Thomas C L,Jones L,Baulcombe D C,et al.Size constraints for targeting post-transcriptional gene silencing and for RNA-directed methylation in Nicotiana benthamiana usinga potato virus X vector[J].Plant,2001,25:417-425.

[44]Covey S N,Al-kaff N S,Langara A,et al.Plants combat infection by gene silencing[J].Nature,1997,385:781-782.

[45]Ratcliff F G,MacFarlane S A,Baulcombe D C.Gene silencing without DNA:RNA-mediated cross protection between viruses[J].Plant Cell,1999,11:1207-1215.

[46]Roossinck M J.Cucumber mosai virus，a model for RNA virus evolution[J].Mol Plant Pathol,2001,2：59-63.

[47]Voinnet O,Baulcombe D C.Systemic signalling in gene silencing[J].Nature,1997,389：553.

[48]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional silencing in plant[J]. Science,1999,286：950-952.

[49]Bosher J M,Labouesse M．RNA interference genetic wand and genetic watchdog[J].Nat Cell Biol，2000,2：E31-E36.

[50]Bestor T H.Gene silencing as a threat to the success of gene threapy[J].J Clin Invest，2000,105：409-411.

[51]Palauqui J C,Elmayan T,Pollien J M,et al.Systemic acquired silencing:transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions[J].EMBO,1997,16:4 738-4 745.

[52]Voinnet O,Lederer C,Baulcombe D C.A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana[J].Cell,2000,103:157-167.

[53]Smith N A,Singh S P,Wang M B,et al.Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407:319-320.

[54]Schiebel W.RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves Catalytic in vitro properties[J].J Biol Chem, 1993,268：11 858-11 867.

[55]Tavernarakis N,Wang S L,Dorovkov M,et al.Heritable and inducible genetic inter-ference by dsRNA[J].Nat Genet,2000,24：180-183.

[56]Stoutjesdijk P A,Singh S P,Liu Q,et al.hpRNA-mediated targeting of the Arabidopsis FAD2 gene gives highly efficient and stable silencing[J].Plant Physiol,2003,129: 1 723-1 731.

[57]牛颜冰，郭失迷，宋艳波，等.RNA沉默-新型的植物病毒病害防治策略[J].中国生态农业学报，2005（13）：47-51.

[58]Anastasia M,Kriton K,Alexandra B,et al.Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y（PVY）through RNA silencing[J].Mol Breeding,2004,14：185-197.

[59]Tenllado F,Cesar L,JoseRamon D R.RNA interference as new biotechnological tool for the control of virus disease in plants[J].Virus Res,2004：85-96.

[60]Tenllado F,Barajas D,Vargas M,et al.Transient Expression of homologous hairpin RNA causes interference with plant virus infection and is overcome by a virus encoded suppressor of gene silencing[J].MPMI,2003,16：149-158.

[61]Timmons L,Donald L C,Andrew F.Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans[J].Gene, 2001,263：103-112.

[62]Tenllado F,Belen M G,Marisol V,et al.Crude extgracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections[J].BMC Biotechnology, 2003,3：3-13.

[63]Zhao M M,An D R,Zhao J,et al.Transiently expressed short hairpin RNA targeting 126kDa protein of tobacco mosaic virus interferes with virus infection [J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2006,38：22-28.

[64]张德咏，朱春晖，成飞雪，等.表达dsRNA的细菌提取液可抑制黄瓜花叶病毒对烟草的侵染[J].植物病理学报，2008（6）：304-311.

Progress on Post-transcriptional Gene Silencing and Anti-virus of Plant

ZHU Chunhui1,ZHANG Deyong2,LIU Yong2
(1.Department of Longping,Zhongnan University,Changsha 410125;2.Hunan Institute of Plant Protection)

The discovery,definition,mechanism,the relation with plant anti-virus of post-transcriptional gene silencing (PTGS),and controlling plant virus through PTGS are summarized.

Post-transcriptional gene silencing;Double-stranded RNA;Anti-virus

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.08.001

朱春晖（1980-），女，在职博士，助理研究员，研究方向是植物病毒分子生物学，电话：0731-84411303，13782032139。E-mail：zhuchunhuizhb@yahoo.com.cn

2009-10-09