36例血友病A相关抑制物检测分析

伍柏青，程洪波，龚旭疆

(江西省人民医院，江西 南昌 330006)

血友病A又称凝血因子Ⅷ缺乏症，是一种临床上最常见的由于FⅧ基因突变所引起的X染色体隐形遗传性出血性疾病 。目前临床上以替代治疗为主，即间断输注外源性凝血因子Ⅷ以维持机体正常的凝血功能，但少数患者在经过若干次Ⅷ因子制剂的输注后，可产生抗Ⅷ因子抗体，使外源性凝血因子Ⅷ失活而影响治疗效果，该抗体被称为凝血因子Ⅷ抑制物。本研究对36例血友病A患者进行FⅧ抑制物定性及定量分析，从而判断患者抗体存在状况，进而指导临床诊断和治疗，现报告如下。?

材料与方法

1研究对象 资料来源于2009年11月～2010年8月间，我院血液科收治的诊断明确、资料完整的血友病A患者36例，均为男性患者，年龄范围从1岁～50岁，13岁以下26例。

2试剂与仪器 标准人类血浆、因子Ⅷ活性测定试剂、APTT试剂、PT试剂、氯化钙溶液等试剂购自德国SIEMENS公司,所有检测在日本Sysmex CA-7000全自动血凝分析仪上进行。

3 方法

3.1 血友病A确诊试验 每个病人进行PT、APTT、和VIII:C测定。

3.2 血友病A抑制物定性试验

3.2.1 取20份以上无黄疸、无溶血、无脂浊且APTT结果范围为28～32s的血浆混合在一起，制成正常混合血浆备用。

3.2.2 准备3个塑料试管分别标记A、B、C，在A管内加入0.5ml正常混合血浆，B管内加入0.5ml血友病A患者血浆，C管内加入正常混合血浆和血友病A患者血浆各0.2ml。将3管血浆均37℃孵育2h，再将A管和B管1:1混合形成D管。即刻对A、C、D管进行APTT检测。

3.2.3 结果判断 C管APTT结果与A管相差10s以上，且C管APTT结果明显长于D管，说明血浆中存在时间依赖性凝血因子抑制物，即FVIII抑制物定性试验阳性。

3.3 Nigmegen方法定量检测抗体

3.3.1 抗体单位定义 37℃孵育2h后，中和正常血浆(FVIII活性100%)中50%的FVIII所需抑制物的量为1BU。

3.3.2 Nijmegen混合血浆的制备 采集20份健康人全血各5ml(以咪唑枸橼酸钠抗凝)，立即分离血浆，混合后备用。

3.3.3 Nijmegen血浆定标 将上述制备的混合血浆FVIII活性调整为100%后，加等量的乏VIII因子血浆混匀作为标准品进行定标。

3.3.4 抑制物定量检测 将患者血浆用缓冲液稀释，再加入等量Nijmegen血浆后置于37℃水浴2h(加盖)。用一期法进行因子活性检测，检测各管的FVIII:C水平。

3.3.5 取最接近50%活性的稀释度，利用计算公式log(100/50)(100/Ⅷ:C)，然后乘以相应的稀释倍数即为该份标本的抗体滴度。

结 果

1 全部36例血友病A患者PT、APTT、和FVIII:C 以及抑制物定性试验和定量结果见表1。表中所示：A为正常混合血浆APTT结果；C为混合血浆和患者血浆1:1混合再孵育后APTT结果；D为混合血浆和患者血浆孵育后再1:1混合的APTT结果。

表1 36例血友病A检测结果

2抑制物定性试验结果：07、28号患者存在时间依赖性凝血因子抑制物，定性试验阳性，其它均为阴性。

3抑制物定量结果：

07 抗体计算：log(100/50)(100/49.1)×32(稀释倍数)=log10(100/49.1)/log10(100/50)×32=0.3089/0.3010×32≈33BU

28 抗体计算：log(100/50)(100/51.6)×64(稀释倍数)=log10(100/51.6)/log10(100/50)×64=0.2874/0.3010×64≈61BU

讨论

血友病A是X染色体连锁的隐形遗传性疾病，女性常是携带者(患者极为罕见)，而男性则是患者。其发病率各国报道不一，国外报道为(4.6～14)/10万，我国1999年邵宗鸿等报道为 (1.95～2.40)/10万，而世界卫生组织(WHO)和世界血友病联盟(WFH)的资料显示，血友病A的发病率约为1/10000，其中重型的发生率为1/16000[1]。血友病A的主要临床表现是自幼反复发生多处组织器官异常出血，其中关节出血是最常见且具有特征性的出血表现，也是血友病患者致残的主要原因[2]。本文收集的36例患者均有不同程度的出血，关节因出血畸形的有5例，其中1例为双踝关节蹠屈位跟骨截骨手术患者，该患者围手术期使用了大量Ⅷ因子，但连续的FⅧ抑制物监测始终阴性。

血友病A的诊断主要依赖实验室的诊断，一般分为筛选试验：活化部分凝血活酶时间(APTT)，确诊试验：Ⅷ因子活性检测(FⅧ:C)；而血友病A的抑制物检测则有定性试验(APTT纠正试验)和抗体定量检测，定量检测方法主要有经典的Bethesda方法和改良的Nijmegen方法，Nijmegen方法是在前者的基础上进行改进，将患者血浆用缓冲液稀释后加正常人混合血浆(咪唑枸橼酸钠抗凝)共同温浴以保证检测体系pH值的稳定，结果更加可靠，适合低滴度抗体的检测[3]。

血友病A的治疗主要有替代治疗和基因治疗两种，由于基因治疗效果和安全性方面还存在一定的不足，目前临床上治疗仍以输注血源性或基因重组FⅧ制剂为主。但有少数患者输注替代FⅧ后会产生中和抗体，这种抗体严重影响FⅧ输注效果，尤其是患者发生大出血时，不能通过输注FⅧ来有效提高患者血液中FⅧ浓度，直接威胁患者生命安全。因此，FⅧ抑制物的检测对进行替代治疗的患者就显得尤为重要。本研究针对我院资料完全的血友病A患者在多次输注FⅧ制剂后，进行抑制物检测，观察有无抗体的产生，评估其治疗效果。36例患者抑制物定性试验阳性的2例，再进行抗体定量检测，抗体分别为33BU和61BU。

FⅧ抑制物是临床上最常见的引起出血的凝血因子抑制物，产生主要受遗传和环境因素影响，其中遗传因素包括：FⅧ基因突变、疾病的严重程度，抑制物家族史，种族和HLA基因型等；环境因素包括：首次使用FⅧ制剂的年龄，FⅧ暴露天数、患者免疫状态及伴随炎症因素等[4-7]。FⅧ抑制物存在的患者往往出血症状突然加重，频率增加，以往的治疗常发生无效的现象。治疗原则为迅速止血和清除抗体，考虑抑制物的滴度和患者的出血情况。止血主要采用的生物制剂和药物有：人FⅧ浓缩物、重组的FⅧ浓缩物、猪FⅧ浓缩物以及FⅧ旁路制剂(活化凝血酶原复合物浓缩剂、重组活化的FⅦ)，清除抗体使用的方法有血浆置换、免疫耐受等[1]。我们检出的存在抑制物的患者临床观察发现用常规治疗方法效果较差，出血仍在继续。但在加大输注Ⅷ因子和使用一些清除抗体的方法，病情有所好转。其中1例患者3个月内连续检测其抗体滴度，显示依次为61BU→53BU→44BU下降趋势，病情也有所缓解。本研究对输注Ⅷ因子的血友病A患者进行抑制物作定性定量检测，能尽早发现患者抗体的产生，有助于临床对该疾病的早诊断、早治疗和预后判断。

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[2]杨仁池,王鸿利.血友病[M].上海:上海科学技术出版社,2007.6.第一版.

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