低氧状态下联合培养骨髓基质干细胞及其诱导来源的内皮细胞的实验研究

张超 曲伟栋 赵华强

低氧状态下联合培养骨髓基质干细胞及其诱导来源的内皮细胞的实验研究

张超 曲伟栋 赵华强

目的在低氧条件下联合培养兔骨髓基质干细胞（Bone Marrow Stromal Cell，BMSC）及由其诱导而来的内皮细胞（Endothelial Cell，EC），观察并探讨低氧状态及EC对BMSC增殖的影响。方法从兔骨髓中分离获得BMSC，体外培养扩增后取部分向EC诱导。实验分4组：①BMSC常氧培养组；②BMSC低氧培养组；③BMSC+EC常氧联合培养组；④BMSC+EC低氧联合培养组。通过观察细胞的形态、增殖能力等了解低氧条件及EC对BMSC生长的影响。结果BMSC可诱导为EC，EC与BMSC混合生长良好。MTT法检测显示，低氧培养组的细胞增殖能力明显高于常氧培养组（P＜0.01），但相同条件下的BMSC单独培养组和BMSC+EC联合培养组间的细胞增殖能力没有显著性差异（P＞0.05）。结论在一定时间内，低氧培养可以促进BMSC的增殖；BMSC来源的EC不能促进BMSC的增殖。

骨髓基质干细胞 内皮细胞 低氧 联合培养

骨髓基质干细胞（BMSC）已成为骨组织工程理想的种子细胞来源之一[1]，体外培养BMSC并向成骨细胞诱导的技术已日趋成熟[2]。研究发现，快速而有效的血管化是组织工程骨移植成活的关键[3-4]。在血管形成方面，内皮细胞（EC）是重要的参与细胞，有学者尝试将成骨细胞与血管内皮细胞联合培养，以期获得组织工程骨的快速血管化[5-7]。但成骨细胞和血管内皮细胞获取困难，不易分离培养，易老化。

在骨损伤后和骨修复的初期，成骨再生反应是在低氧环境中进行的[8]。本实验将自体BMSC向EC诱导，并与BMSC联合培养，以了解低氧条件及EC对BMSC增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器设备

低糖DMEM培养基（Hyclon公司，美国）；胎牛血清 （杭州四季青公司，中国）；Percoll分离液（Pharmacia公司，瑞典）；二甲基亚砜DMSO、四甲基偶氮唑蓝MTT（Amersico公司，美国）；M199培养基（Invitrogen公司，美国）；兔源性CD34抗体、免疫组化ABC检测试剂盒 （北京博奥森生物技术有限公司，中国）；低氧恒温CO2培养箱（Rsbiotech公司，英国）。

1.2 实验方法

1.2.1 兔骨髓基质干细胞的分离和培养

3周龄新西兰大白兔，雌雄不限，无菌条件下取股骨，去除干骺端后用完全DMEM-LG培养基（青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL，10%FBS）反复冲洗骨髓腔，离心弃上清后制成细胞悬液，加入到另一离心管内（含等量的1.077 g/mL的Percoll分离液），2 000 r/min离心20 min，缓慢吸取中间乳白色云雾状悬浮的单个核细胞层，加入完全DMEM-LG培养基，接种于塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下细胞培养箱中进行培养，3 d天后首次换液，以后每2～3 d更换一次培养基，约7～10 d后细胞融合成单层时进行传代培养。

1.2.2 兔骨髓基质干细胞向内皮细胞的诱导培养和鉴定

将第1代骨髓基质干细胞消化，离心去上清，转移至培养瓶内，更换内皮诱导培养液（M199基础培养基、血管内皮细胞生长因子VEGF 10 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子bFGF 2 μg/L），3 d后首次换液；以后每2～3 d换液，持续诱导。融合成单层细胞后用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化传代，所获得的细胞CD34+，呈内皮细胞属性。

1.3 MTT法检测低氧条件下BMSC和EC联合培养的细胞增殖情况

1.3.1 实验分组

实验分4组：①BMSC常氧培养组；②BMSC低氧培养组；③BMSC+EC常氧联合培养组；④BMSC+ EC低氧联合培养组。各组细胞均以1×103个/孔接种于96孔培养板内，每组6孔；联合培养组中BMSC与EC比例为1∶1，培养基为完全DMEM-LG培养基；每2～3 d更换一次培养基，培养7 d；低氧培养组的氧浓度为1%。4组细胞每隔24 h行MTT检测，共7次

1.3.2 MTT法检测各组细胞增殖情况

吸除孔内培养基，用不含FBS的DMEM-LG培养基冲洗后，更换培养基为含0.5%FBS的DMEMLG培养基，同时每孔加入0.5%的MTT 20 μL，继续在37℃细胞培养箱内培养4 h后，吸去孔内培养液，于每孔中加入150 μL的DMSO，振荡10 min，在分光光度仪490 nm波长下测定吸光值（OD值）。所测OD值用（均数±标准差）表示，绘制各组细胞生长曲线，采用SPSS11.0统计软件处理，在SPSS11.0上进行方差分析和q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC形态学观察

刚接种的BMSC呈球形，悬浮于培养液中并逐渐贴壁展开，3 d后大部分BMSC在培养瓶底贴壁散在分布；首次换液后，见贴壁细胞多呈三角形和多角形；培养7 d后，细胞集落迅速增多，呈漩涡状排列，细胞形态为长梭形或立方状，单层均匀紧密排列（图1）。传代后，细胞形态更加单一，5～6 d即可铺满瓶底，若继续培养，细胞呈复层生长，逐渐老化死亡。

图1 BMSC原代培养第7天（倒置相差显微镜，100×）

2.2 BMSC诱导为EC

原代细胞诱导培养3 d后，可见细胞贴壁，但未完全展开，5～7 d后，细胞贴壁，部分形成集落，细胞小，呈梭形；传代后，细胞逐渐变大，由梭形变为多角形（图2），CD34+，胞浆棕黄色，提示细胞为内皮细胞属性（图3）。

2.3 联合培养细胞的形态学观察

BMSC和EC联合培养，可见两种细胞混合生长，相容性好，BMSC体积较大，EC体积较小（图4）。

2.4 MTT法检测细胞增殖情况

各组细胞数量在第1、2天无明显增加，第3天细胞数量开始明显增加，至第6天一直处于快速增长期，至第7天生长趋势开始变缓（表1）（图5）。第1、2天各组细胞间增殖能力无显著性差异 （P＞0.05），第3～7天，低氧培养的细胞增殖能力均明显高于常氧培养（P＜0.01）。连续培养的7 d内，单独培养和联合培养的细胞增殖无显著性差异（P＞0.05）。

图2 EC第1代培养第3天（倒置相差显微镜，100×）

图3 传代后EC呈CD34+（倒置相差显微镜，100×）

图4 低氧条件下BMSC+EC联合成骨诱导培养第7天（倒置相差显微镜，100×）

图5 4组培养细胞体外培养的生长曲线

3 讨论

种子细胞是组织工程化骨构建的首要环节和基本要素，BMSC具有来源广泛、取材方便、增殖快、生长稳定等优点[9]，已成为应用最广泛的种子细胞来源之一，体外培养并成骨诱导的技术已日趋成熟，Maniatopoulos等[10]首次报道鼠BMSC在体外能形成骨样组织。

近年来,应用组织工程化骨修复骨缺损取得了较大进展，但大块骨的缺损仍无法修复，其中一个重要原因就是血管化的问题。组织工程化骨体积越大，越需要更多的血管为其提供营养，血管化是骨形成的重要基础[11]。因此，如何快速血管化成为组织工程化骨应用于临床的关键。血管化的形式包括血管生成和血管形成[12-13]，这两种形式均可通过诱导因子促进，其中具有代表性的是血管内皮生长因子（VEGF）。VEGF在血管化中起着重要作用，但在体内的半衰期十分短暂，若直接放置于人工骨中，无法达到促血管形成的作用。因此，骨组织工程应用VEGF的策略大致有两大类：一是放置缓释系统[14-15]；二是应用可持续释放VEGF的细胞，如EC等。EC既能直接参与血管化，还能持续释放VEGF，促进血管化[16]。体外成骨细胞和血管内皮细胞联合培养可以促进成骨和血管形成[17],但成骨细胞和血管内皮细胞获取困难，不宜分离培养，且培养时易老化。因此，本实验以自体BMSC和由其诱导而来的EC联合培养，以此来观察EC对BMSC增殖的影响。结果提示，BMSC与诱导获得的EC联合培养，对BMSC的增殖无明显促进作用。

表1 4组细胞在不同时间点的平均OD值（490 nm）

在骨损伤后，周围的微环境由于血供的减少会发生低氧，在损伤的中心区域会降低到2%以下，所以骨组织损伤后的成骨再生反应是在低氧环境中进行的。本实验采用1%的低氧条件进行培养，与常氧条件相比，在一定时间内能明显促进BMSC的增殖。

但需要注意的是，骨损伤修复的体内环境比体外单纯低氧环境要复杂得多，大块组织工程化骨的快速高效的血管化是其临床应用的重要基础和成功保证，尚需在这方面进行更多的深入研究。

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Experimental Study of Bone Marrow Stromal Cells and Induced Endothelial Cells in Co-Culture under Hypoxia

ZHANG Chao,QU Weidong,ZHAO Huaqiang.

Department of Oral and Maxillofacial, Shandong University School of

Stomatology,Jinan 250012,China.Corresponding author:ZHAO Huaqiang.

Objective To investigate the influence of hypoxia and co-culture of endothelial cells (EC)induced from BMSC and autologous bone marrow stromal cells(BMSC)on the proliferation of BMSC.Methods The rabbit BMSC were isolated and were induced into endothelial cells.These cells were divided into four groups.①BMSC group cultured under normoxia;②BMSC group cultured under hypoxia;③BMSC+EC group co-cultured under normoxia;④BMSC+EC group co-cultured under hypoxia.Inverted microscope and MTT method were applied to observe the effects of hypoxia and induced autologous EC on the cellular compatibility of BMSC. Results Endothelial cells could be induced from BMSC.Inverted microscope showed a cellular compatible growing status of BMSC and EC. The ability of proliferation of groups cultured under hypoxia were stronger than groups cultured under normoxia (P＜0.01),but there was no significant difference between BMSC groups and BMSC+EC groups(P＞0.05).Conclusion The hypoxia can increase the proliferation of BMSC.While the endothelial cells induced from BMSC can not.

Bone marrow stromal cell;Endothelial cell;Hypoxia;Co-culture

Q813.1+1

A

1673-0364（2010）06-0315-04

2010年8月30日，

2010年9月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.004

250012 山东省济南市 山东大学口腔医学院口腔颌面外科(张超 曲伟栋 赵华强)。

赵华强。