腺病毒介导HGF基因转染对人脂肪干细胞生物学特性影响的研究

吴一杰 王黔 穆大力 栾杰

腺病毒介导HGF基因转染对人脂肪干细胞生物学特性影响的研究

吴一杰 王黔 穆大力 栾杰

目的观察腺病毒介导的HGF基因转染对人脂肪干细胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）生物学特性的影响。方法利用腺病毒介导HGF（MOI=200）转染hADSCs，检测转染组细胞目的基因HGF表达情况，并与未转染组细胞的形态、细胞生长曲线、细胞表面标志物、细胞周期和成脂、成骨诱导分化能力进行比较。结果hADSCs转染24 h后，即可检测出HGF，并于48 h后达到高峰，1周后HGF表达逐渐降低。hADSCs转染后仍呈成纤维细胞样生长，其生长增殖能力与未转染hADSCs无明显差别；转染后的hADSCs仍表达CD44、CD90、CD49d、CD105，不表达CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1。转染组与未转染组细胞周期、成脂和成骨诱导分化能力无明显差别。结论腺病毒表达载体介导HGF基因转染hADSCs并不影响其生物学特性，是将hADSCs用于基因治疗的良好途径。

人脂肪干细胞 腺病毒表达载体 基因转染 生物学特性

人脂肪干细胞 （Human adipose derived stem cells，hADSCs）是组织工程理想的种子细胞，由Zuk等[1]于2001年首次分离获得。hADSCs具有来源丰富、易于获取、自体移植可以避免排斥反应、可分化为多种中胚层来源细胞及跨胚层分化等优点[2-4]。研究证实，hADSCs在体外培养可以稳定增殖，在不同的诱导条件下，hADSCs可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等[5]。利用种子细胞作为基因治疗的载体具有广阔的应用前景，而hADSCs是外源性基因的最为有效的细胞载体之一，可使外源性基因在体内持续地发挥生物学作用。腺病毒转染是调控基因、构建基因表达载体最有利的工具之一[6]，而腺病毒可以高效转染hADSCs。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）具有强大的促血管生长作用[7]，将HGF利用腺病毒转染到hADSCs中并移植到受区，使HGF在受区持续发挥促血管生长作用，是再生医学中具有广阔应用前景的治疗方式。但腺病毒介导HGF转染对hADSCs生物学特性是否有影响尚不十分清楚，如果改变其生物学特性可能会对以后的实验及临床应用造成一定影响。因此，本研究拟针对Ad-HGF转染的hADSCs与未经转染的hADSCs的生物学特性进行比较。

1 材料

1.1 腺病毒

携带人肝细胞生长因子基因的腺病毒基因表达载体（Ad-HGF）和携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体（Ad-GFP）由军事医学科学院放射医学研究所实验血液学实验室馈赠。

1.2 人脂肪组织来源

脂肪来源于中国医学科学院整形外科医院吸脂患者。经知情同意，局麻下行腹部抽脂，获取脂肪颗粒，生理盐水充分洗涤，静置约10 min，去除上清液，获得纯度较高的脂肪颗粒。

1.3 主要试剂

L-DMEM培养基、胎牛血清（HyClone公司）；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、卡那霉素、青霉素、诱导培养基(Sigma公司)；ELISA检测试剂盒 （R&D公司）；MTT (Amerison公司)；CD90、CD44、CD49d、CD105、CD34、CD31、CD45、CD106、STRO-1(Sigma公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

取10 mL脂肪颗粒加入0.125%Ⅰ型胶原酶10 mL，37℃摇床250 r/min震荡消化45 min，然后用等量含10%胎牛血清的L-DMEM中和胶原酶，1 300 g离心7 min，去上层未消化的脂肪组织及上清，加3 mL L-DMEM悬浮沉淀物，筛网过滤，再次离心，弃上清，加入10 mL含10%胎牛血清LDMEM重悬沉淀物，再次筛网过滤，接种至培养皿中。次日换液，之后每隔2 d换液，7 d后胰蛋白酶消化传代。第2代hADSCs用于转染、检测以及诱导等。选择L-DMEM，是因为L-DMEM更适合培养hADSCs，低糖可能更有利于维持hADSCs的多向分化潜能[8-9]。

2.2 腺病毒扩增纯化及滴定

2.2.1 利用293细胞扩增腺病毒

将293细胞接种于150 mm平皿，扩增至60个平皿，待细胞生长至90%融合时进行病毒感染，感染48 h后细胞出现完全细胞病变效应时，收集细胞及少量上清液，液氮和室温下反复冻融3次，使细胞破裂释出病毒颗粒，2 500 r/min离心10 min，弃细胞碎片，收集上清液约10 mL，-80℃保存。

2.2.2 氯化铯密度梯度离心法纯化病毒

依次将1.4 g/mL CsCL溶液 2.5 mL、1.2 g/mL CsCL溶液2.5 mL加入超速离心管中，将冻融后的待纯化病毒加于CsCL梯度溶液之上。28 000 r/min 10℃离心2 h，1.4 g/mL CsCL溶液和1.2 g/mL CsCL溶液之间出现白色雾状病毒带，上层为缺陷病毒，下层为完整病毒，尽量吸取下层病毒，与 1.3 g/mL CsCL溶液5 mL混合，28 000 r/min 10℃离心16 h。吸取白色雾状病毒带，以1～2倍体积的PBS稀释。以PBS为透析液于4℃透析病毒，每2 h更换一次透析液，共换5次。取出纯化的病毒，加入灭菌甘油至终浓度为10%，分装，-80℃冻存。

2.2.3 噬斑分析法滴定病毒滴度

病毒浓度梯度的配制：10-2～10-14，加入96孔板中，每个孔加100 μL对应浓度的病毒，对照组直接加100 μL培养基。培养10 d后，观察各孔噬斑和CPE现象，确定病毒滴度。以最高浓度孔为全阳、最低浓度孔和对照孔为全阴的测定结果为有效结果。感染滴度（pfu/mL）＝平均噬斑数×稀释倍数，根据公式计算病毒滴度为：2×1011pfu/mL。

2.3 筛选转染浓度

将第2代细胞接种于24孔板中，等细胞生长至80%融合，Ad-GFP、Ad-HGF分别以 MOI为50、100、200、300、400、500、1 000转染hADSCs。方法如下：吸弃孔内培养基，加入Ad-HGF、Ad-GFP的无血清L-DMEM培养基，37℃，5%CO2孵育2 h，期间摇匀2次，去除含病毒培养基，然后换成含10 mL 10%胎牛血清的L-DMEM继续培养。每天用荧光显微镜观察细胞状态和GFP绿色荧光蛋白的表达情况。24 h、48 h收集Ad-HGF组细胞上清液之后，每隔48 h收集该组细胞上清液（-80℃冻存），持续至第10天。

2.4 细胞形态学观察

将第2代hADSCs接种于6孔板中，分为对照组和转染组，为了便于观察单个细胞形态，待hADSCs长到60%融合时即可转染，以MOI=200转染2 h，更换含10%胎牛血清的L-DMEM，1 d后镜下观察细胞形态，连续观察10 d。

2.5 绘制转染组和对照组hADSCs生长曲线

将第2代hADSCs以1×105cells/mL的密度接种于96孔板，待贴壁转染组转染腺病毒2 h，换成含10%胎牛血清的L-DMEM，次日开始MTT测定。两组各选3孔加入20 μL MTT，37℃孵育4 h，吸弃含MTT的培养基，加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.6 细胞表面标志物测定

将第1代hADSCs接种于6孔板中，待细胞80%融合，转染3孔为实验组，另3孔为对照组。

2.7 细胞周期测定

将第2代hADSCs接种于24孔板中，每组细胞接种6孔，共18孔。待细胞80%融合时，转染9孔为实验组，另9孔为对照组，流式细胞仪检测，得出两组细胞的G2/G1周期。

2.8 诱导成脂和诱导成骨

2.8.1 成骨诱导

第2代hADSCs接种至6孔板中，其中3孔分别为转染后加入成骨诱导培养基的实验组 （A组）、正常hADSCs加入诱导培养基的对照组 （B组），hADSCs加入普通全培养基的空白对照组（C组）。

成骨诱导培养基：0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸、含10%胎牛血清的L-DMEM。加入诱导培养基后，每3 d换液，至第20天。

2.8.2 成脂诱导

第2代hADSCs接种至6孔板中，其中3孔分别为转染后加入诱导成脂培养基的实验组 （A组）、正常hADSCs加入诱导培养基的对照组 （B组）、hADSCs加入普通全培养基的空白对照组（C组）。

成脂诱导培养基：0.5 mol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L消炎痛、含10%胎牛血清的L-DMEM。

加入培养基后，每3 d换液，至第14天，进行油红染色。

3 结果

3.1 转染48 h后HGF表达量的测定

通过荧光显微镜观察，Ad-GFP以MOI=100、 MOI=200、MOI=300时转染效率均可达到90%以上；转染组细胞上清液ELISA分析显示，48 h时HGF表达量最高,Ad-HGF以MOI=200转染时细胞HGF表达量最高（图1）。

图1 转染48h后HGF表达量的测定

3.2 细胞形态

对照组和转染组hADSCs在48 h时，细胞均呈成纤维细胞样生长，细胞形态未见明显差异（图2）。

图2 两组细胞形态未见明显差异

3.3 细胞生长曲线

转染组与对照组细胞生长曲线相似，数值相差甚小，生长趋势吻合（图3）。

图3 细胞生长曲线

3.4 细胞表面标志物：

流式细胞仪测定细胞表面标志物显示，两组细胞 CD44、CD90、CD49d、CD105均呈阳性表达，CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1均呈阴性表达（图4）。

图4 流式细胞仪检测

3.5 细胞生长周期

经流式细胞仪检测，转染组和对照组G2/G1期细胞分别为（1.9548±0.0522）和（1.9756±0.0324），差别无统计学意义（P＞0.05）。

3.6 分化能力比较

3.6.1 诱导成骨

加入成骨诱导培养基A、B两组均可明显看到钙结节，加入普通培养基的C组无明显钙结节形成（图5）。A、B两组的各3孔均取5个视野，以Image Pro Plus软件进行分析，钙结节面积占视野面积比例分别为：A组（44.1±3.8）%，B组（42.7±2.1）%，P＞0.05。

图5 成骨诱导结果

3.6.2 诱导成脂

加入成脂诱导培养基的A、B两组均可明显看到脂滴，C组无明显脂滴形成。A、B两组各3孔均取5个视野，以Image Pro Plus软件进行分析，脂滴面积占视野面积比例分别为：A组 （30.6±2.2）%，B组（32.4±1.3）%，P＞0.05。

4 讨论

选择理想的种子细胞是组织工程与基因治疗的重要课题之一，利用细胞作为载体，使各种目的基因在体内有效持续表达，是目前最具有应用前景的基因治疗手段。hADSCs作为一种拥有多项优势的成体多能干细胞，受到广泛关注。而重组利用腺病毒载体整合外源性基因具有安全性、高效性和稳定性，是目前基因工程中最常用的病毒载体。将具有强大促血管生成能力的HGF以腺病毒转染到脂肪干细胞中再移植到体内，是解决移植脂肪成活问题极有前景的方式。采用人脂肪干细胞作为腺病毒表达载体是否对其生物学特性产生影响，目前研究甚少，因此该方面的研究将会为组织工程和基因治疗提供重要的理论基础。

本研究采用传统的hADSCs分离培养方法，通过与未转染的对照组比较，观察转染对于hADSCs生物学特性的影响。

首先通过对转染率和基因表达率的双重筛选，选取Ad-HGF转染hADSCs的较佳浓度。一般认为，较低或过高的MOI都会对载体转染的效率产生不利影响。Morizono等[10]报道，当MOI=100时，腺病毒对hADSCs的转染效率可达到99%； Hiroyuki等[11]报道，当MOI=300时，腺病毒对hADSCs的转染效率可达到95%。以往研究证实，过高浓度的腺病毒载体并不能提高转染效率，反而会引发机体的免疫反应，并由于细胞凋亡而导致基因表达效果下降。我们通过荧光显微镜观察，发现Ad-GFP以MOI= 100、MOI=200、MOI=300时转染效率均可达到90%以上，转染组细胞上清液ELISA分析，48 h时HGF表达量最高,Ad-HGF以MOI=200转染时细胞HGF表达量最高。因此，从转染率和基因表达量两方面综合考虑，MOI=200为Ad-HGF转染hADSCs较佳的浓度。

细胞形态学方面，两组hADSCs均为梭形和多角形，呈成纤维细胞样生长，形态无明显差异，与已往研究报道一致，表明Ad-HGF转染对hADSCs形态并无明显影响。

MTT法绘制细胞生长曲线，两组生长趋势一致,故Ad-HGF转染并未影响hADSCs生长增殖能力。观察到转染组细胞数稍低于对照组，我们认为可能是腺病毒转染本身会造成少量细胞死亡,故细胞数初始值即低于对照组。

细胞表面标志物的检测，两组CD44、CD90、CD49d、CD105均呈阳性表达，CD45、CD34、CD31、CD106和STRO-1均呈阴性表达，与已有文献[12]。本实验结果证实，我们所用的细胞的确为hADSCs，转染并没有造成细胞表面标志物的改变。

检测细胞周期发现，两组种G2/G1期细胞差异无统计学意义，证明Ad-HGF转染对ADSC细胞周期没有明显影响。

分别成骨成脂诱导后，两组细胞均可分化为成骨细胞和脂肪细胞（脂滴），证明转染后的hADSCs仍然具有多向分化潜能。Image Pro Plus软件分析结果显示，两组细胞在分化能力方面差别微小。

腺病毒转染对hADSCs的生物学特性影响很小，hADSCs仍然保持了它的干细胞特性，为今后的进一步实验奠定了基础。

致谢 北京协和医学院整形外科医院实验中心、整形八科和军事医学科学院二所三室对本实验给予了支持和指导，在此一并表示感谢。

[1] Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al．Multilineage cells from human adipose tissue:implication for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-227.

[2] Giese SY,Bulan EJ,Commons GW,et al.Improvements in cardiovascular risk profile with large-volume liposuction:a pilot study[J].Plast Reconstr Surg,2001,108:510-521.

[3] Baksh D,Song L,Tuan RS.Adult mesenchymal stem cells: characterization,differentiation,and application in cell and gene therapy[J].J Cell Mol Med,2004,8(3):301-316.

[4] Safford KM,Safford SD,Gimble JM,et al.Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells[J].Exp Neurol,2004,187(2):319-328.

[5] Perry TE, Roth SJ. Cardiovascular tissue engineering: constructing living tissue cardiac valves and blood vessels using bone marrow,umbilical cord blood,and peripheral blood cells [J].J Cardiovasc Nuts,2003,18(1):30-37.

[6] Hauser MA,Amalfltano A,Kumar SR,et al.Improved adenoviral vectors for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy [J]. Neuromuscul Disord,1997,7(5):277-283.

[7] Ido A,Moriuchi A,Marusawa H,et al.Translational research on HGF: a phase I/II study of recombinant human HGF for the treatment of fulminant hepatic failure[J].Hepatol Res,2008,38: 88-92.

[8] Yeh P,Perricaudet M.Advances in adenoviral vectors:from genetic engineering to their biology[J].FASEB J,1997,11(8):615-623.

[9] Mischen BT,Follmar KE,Mover KE,et al.Metabolic and funetional characterization of human adipose derived stem cells in tissue engineering[J].Hast Reconstr Surg,2008,122(3):725-738.

[10] Morizono K,De Uqarte DA,Zhu M,et al.Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles[J].Human gene ther, 2003,14(1):59-66.

[11] Hiroyuki M,Tomomi S,Kenji K,et al.Fiber-modified adenovirus vectors mediate efficient gene transfer into undifferentiated and adipogenic-differentiated human mesenchymal stem cells [J]. Bichemical and Biophys Res Commun,2005,332:1101-1106.

[12] Peroni D,Scambi I,Pasini A,et al.Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J].Exp Cell Res,2008,314(3):603-615.

Study on Biological Characteristics of Adipose Derived Stem Cells Transfected with HGF Gene by Adenovirus Vector

WU Yijie,WANG Qian,MU Dali,LUAN Jie.

Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding Author:LUAN Jie.

Objective To investigate the effect of HGF transfection by adenovirus vector (Ad-HGF) on biological characteristics of human adipose derived stem cells(hADSCs).Methods hADSCs was transfected by Ad-HGF in MOI=200. The expression of HGF gene was detected by ELISA.The differences of biological characteristics such as cell morphology, growth curve,surface markers,cell cycle,differentiation potential between hADSCs transfected by HGF group and hADSCs group were observed.Results The expression of HGF was detected in supernatant 24 hours post transfection.The peak of it presented at 48 hours post transfection and sustained till 1 week after transfection. The hADSCs transfected by Ad-HGF grows as fibroblast-like style.There were no morphology and cell viability changes observed between transfected group and control group.Both two groups were shown to be positive for the expression of CD44,CD90,CD49d and CD105.On the other hand,expression of CD45,CD34,CD31,CD106 and STRO-1 were negative.There was no significant difference between two groups in cell cycle,adipogenic and osteogenic differentiation potential were observed. Conclusion The biological characteristics of hADSCs are not affected by adenovirus transfection. Adenovirus transfection is an ideal way to integrate HGF gene to hADSCs.

Human adipose derived stem cells; Adenovirus vector; Gene transfection; Biological characteristics

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）06－0306－05

2010年9月6日，

2010年10月21日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.002

100144 北京 北京协和医学院整形外科医院。

栾杰。