海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究

丁进锋，苏秀榕*，张春丹，李妍妍，徐嘉杰

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

海蜇胶原蛋白提取工艺及促愈合作用研究

丁进锋，苏秀榕*，张春丹，李妍妍，徐嘉杰

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

通过响应面法优化海蜇胶原蛋白的提取工艺，并通过小鼠皮肤创伤模型研究海蜇胶原蛋白的促愈合作用。通过单因素试验选取因素与水平，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，在单因素基础上采用三因素三水平响应面分析法(RSM)，对海蜇胶原蛋白的酸法提取工艺进行优化；采用小鼠皮肤创伤模型，创面外用胶原蛋白，并以云南白药处理为阳性对照，通过十字测量法测量创面大小并计算创面愈合率。结果显示海蜇胶原蛋白的最佳提取工艺条件为提取时间62.64h、液料比23.6:1，醋酸浓度0.562mol/L；动物实验表明海蜇胶原蛋白能够明显缩短伤口愈合时间，对创面修复有促进作用。响应面法优化得到的提取条件准确可靠；海蜇胶原蛋白具有明显的促愈合作用。

海蜇；胶原蛋白；响应面；伤口愈合

海蜇(Rhopilema esculentum Kiahinouye)隶属于腔肠动物门(Coelentera)、钵水母纲(Scyphozoa)、根口水母(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)、海蜇属(Rhopilema)的无缘膜动物。世界已记录的海蜇属只有海蜇(R.esculentum)、黄斑海蜇(R.hispidum)、棒状海蜇 (R. rhopalophorum)和疣突海蜇(R.verrilli)等4种。前3种在我国已有记录。棒状海蜇个体小(40～100mm)，伞部的中胶层薄，数量稀少，没有捕捞价值。作为渔业生产的只有海蜇和黄斑海蜇两种[1]。

海蜇经加工后，伞部称为海蜇皮，口腕部称为海蜇头，二者均具有很高的经济和营养价值，富含较高的蛋白质及钙、磷、碘、铁等无机盐和维生素等营养成分[2]，去水分蛋白质占总干质量的50%左右，其脂肪含量低[3]，是一种高蛋白低脂肪的食品。海蜇不仅是宴席佳肴，也是一味治病良药。海蜇性咸、平，入肝肾，可消热解毒、软坚散结、降压消肿等功效，并对气管炎、哮喘、高血压、口噪咽干、阴虚便秘等有一定的治疗作用[2-5]。海蜇富含一些具有生物活性的物质，如胶原蛋白、毒素、糖胺聚糖、糖蛋白等[5-8]，其中胶原蛋白的含量最为丰富[9]。胶原蛋白由3条α多肽链构成三股螺旋结构，其分子结构十分稳定，分子质量在30kD以上，不利于人体直接吸收。国内外研究表明，水解胶原蛋白的主要产物胶原多肽，具有保护胃黏膜、抗溃疡、抑制血压上升，促进骨形成、皮肤胶原代谢等营养及生理功能，在食品及医药等领域具有巨大的开发前景[10-11]。

伤口愈合是机体所具有的一种修复功能，它包括炎症、增生期、伤口收缩、胶原代谢和上皮形成等一系列复杂过程[12]。胶原具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。因胶原的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛[13]。长期以来，人们都是使用猪、牛的皮和骨提取胶原蛋白和明胶。但因疯牛病、口蹄疫等疾病的爆发对牲畜胶原制品安全性产生疑虑。另外，由于宗教和习俗等原因，有些地区也不能使用牲畜胶原蛋白制品。因此，获得胶原蛋白的新来源显得十分迫切[14]。本实验利用响应面设计酸法提取海蜇胶原蛋白工艺，并研究海蜇胶原蛋白的促伤口愈合作用，旨在为海蜇生物活性物质的进一步研究提供实验依据，并为其在功能食品、医药、化妆品等方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海蜇购于浙江省岱山县；ICR小鼠 浙江省实验动物中心。

L-羟脯氨酸 Sigma公司；氯胺T、盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、高氯酸、无水乙醇、乙二醇独甲醚、对二甲基氨基苯甲醛、浓硫酸、醋酸等均为AR 宁波奥博科学仪器有限公司；云南白药 云南白药集团股份有限公司。

1.2 仪器与设备

T6新悦可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DKS-26电热恒温水浴锅 宁波江南仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白提取

1.3.1.1 单因素试验

选取提取时间、料液比及醋酸浓度三个因素，探讨其对海蜇胶原蛋白提取效果的影响。取一定量捣碎均匀的海蜇，加入适量的醋酸，在4℃条件下浸提一定时间后，10000r/min、4℃离心30min，取上清液，加入6mol/L盐酸后130℃水解6h，测定羟脯氨酸含量[15]。

提取率/%=m/M×100

式中：m为提取的胶原质量/mg；M为海蜇质量/mg。

1.3.1.2 响应面优化提取条件

根据单因素试验确定各因素最佳条件后，以Box-Benhnken中心组合试验设计原理设计试验，设计3因素3水平试验优化海蜇胶原蛋白提取条件。

1.3.2 促愈合作用

1.3.2.1 动物分组及伤口模型建立

ICR小鼠45只，平均质量为(20±2)g。将小鼠随机分为3组，每组15只，分别为正常对照组(NG)、海蜇胶原蛋白组(JG)及云南白药组(YG)。小鼠以戊巴比妥钠腹腔麻醉后，背部去毛，消毒。在小鼠背部剪去直径约1cm的全层皮肤，造成全皮层缺损动物模型。JG组每天涂抹0.2mL 1mg/mL海蜇胶原蛋白溶液，YG组每天涂抹0.2mL 0.6mg/mL云南白药悬浮液。以上各组均用无菌纱布包扎好，每日换药1次，连续14d。每天对创伤口面观察，测量伤口大小，并记录结果。

1.3.2.2 伤口愈合率

每天用游标卡尺测量创面大小(十字测量法)，创伤口面积按椭圆面积计算[16]，并计算伤口愈合率。

S=0.25abπ

式中：a为伤口长轴长度；b为伤口短轴长度。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白提取单因素试验

2.1.1 提取时间对胶原蛋白提取率的影响

图1 提取时间对海蜇胶原蛋白的影响Fig.1 Effect of extraction time on the yield of jellyfish collagen

取一定质量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，液料比为10:1(V/m)，在4℃条件分别浸提12、24、48、72、84h。在48h内，随着浸提时间的延长，胶原蛋白提取率也随之增加，但超过48h后，提取率不再增加，因此提取时间以48h为佳(图1)。

2.1.2 醋酸浓度对胶原蛋白提取率的影响

取一定质量的海蜇，分别加入0.1、0.2、0.5、0.7、1.0mol/L醋酸，液料比为10:1，在4℃条件浸提48h。从图5可看出，随着醋酸浓度的增加，胶原蛋白提取率也增加，在0.5mol/L达到最大，超过0.5mol/L时，提取率无太大影响，因此以0.5mol/L为醋酸最佳浓度。

图2 不同醋酸浓度对海蜇胶原蛋白提取的影响Fig.2 Effect of acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.1.3 液料比对胶原蛋白提取率的影响

取一定质量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，在4℃条件浸提48h，液料比分别为5、10、15、20、25。由图6可看出，液料比较小时，海蜇不能完全浸于其中，提取率低，液料比大时，对胶原蛋白提取率的影响较小，并会造成胶原蛋白分离纯化困难，因此提取海蜇胶原蛋白的最佳液料比为20:1。

图3 液料比对海蜇胶原蛋白提取的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2 响应面法优化海蜇胶原蛋白的提取工艺

2.2.1 分析因素选取

根据单因素试验结果，采用响应面试验设计，选取提取时间(A)、液料比(B)、醋酸浓度(C)，以海蜇胶原蛋白提取率为响应值(Y)做3因素3水平响应面试验设计，因素及水平设计见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应面法分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface method

表2 响应面分析结果Table 2 The results of response surface analysis

由表3方差分析表可知，方程一次项的影响是显著的，提取时间和醋酸浓度二次项的影响也是显著的，交互项作用影响不显著，说明各因素对海蜇胶原蛋白提取率的影响不是简单的线性关系。为明确各因素对响应值的影响，经回归拟合后，试验因素对响应值的影响可用回归方程表示为：Y=0.988＋0.025A＋0.0125B＋0.0125C＋0.0025AB＋0.0125AC＋0.0025BC-0.02525A2-0.01025B2-0.03525 C2

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

从表3结果可看出，整体模型的P≤0.01，表明该回归方差模型极显著，并且失拟项不显著，说明该模型的拟合度较好。

2.2.2 响应面分析及等高线图

从图4可以看出，图4两因素提取时间和液料比交互作用不显著，当提取时间、醋酸浓度一定时，提取率随液料比的增加而增加。从图5、6可以看出，等高线呈椭圆形，说明图中两因素交互作用明显。图5和图6表明，当醋酸浓度一定时，提取率分别随提取时间的延长和液料比的增加而增加，到一定程度后均又有所下降。

图4 提取时间(A)与液料比(B)对海蜇胶原蛋白提取率的影响Fig.4 Response surface plots showing the effects of extraction time and substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

图5 提取时间(A)与醋酸浓度(C)对海蜇胶原蛋白提取率的影响Fig.5 Response surface plots showing the effects of extraction time and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

图6 液料比(B)与醋酸浓度(C)对海蜇胶原蛋白提取率的影响Fig.6 Response surface plots showing the effects of substrate concentration and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2.3 提取工艺的确定

结合回归模型的数学分析可知，海蜇胶原蛋白的提取最佳工艺为：提取时间62.64h、液料比23.6:1、醋酸浓度0.562mol/L，在此条件下海蜇胶原蛋白的预测提取率1.002%。为了验证实验的可靠性，采用最佳提取条件海蜇胶原蛋白，考虑到实验操作的可靠性，将最优提取条件修正为提取时间63h、液料比24:1、醋酸浓度0.56mol/L，在此条件下测定的胶原蛋白的提取率为1.011%，与理论预测值的误差为0.90%，说明采用RSM法优化得到的浸提条件可靠。

2.3 促愈合实验

2.3.1 肉眼观察

小鼠术后1d，各组创面均有湿润，无明显脓液形成，无明显感染，创伤面也未出现明显缩小，伤口边缘的基底细胞开始增生，覆盖于肉芽组织的表面。

术后3d，各组创面均无感染，均出现了不规则的隆起团状硬块，即增生的肉芽组织，伤口收缩不明显。

术后5d，JG组和YG组伤口有明显的收缩，JG和YG组伤口均被填平，团块状隆起，创面完全封闭，而NG组伤口未完全封闭。

术后7d，JG组痂皮已经脱落，边缘新皮组织向中心发展，其他各组还未出现痂皮脱落现象，但用药组肉芽组织体积缩小。

术后10d， JG和YG组痂皮都已自然脱落，伤口大小有明显的变化，瘢痕触之较为柔软，弹性好，活动度较大，而NG组痂皮还有部分未脱落，瘢痕触之较为僵硬，弹性差，活动度小。

2.3.2 各因素处理对创面愈合率的影响

由图7可以看出，术后3d，各因素处理对创面愈合率比NG组有所提高，但是无显著性差异(P＞0.05)；术后5d，JG组和YG组与N组比较，创面愈合率有明显提高(P＜0.05)，术后7d，JG组和YG组与N组相比，愈合率有明显提高(P＜0.01)；而JG组和YG组愈合率提高极显著(P＜0.01)；术后10d，JG组和YG组愈合率较N组有极显著差异(P＜0.01)。

图7 各因素处理后小鼠伤口愈合率Fig.7 The healing rate of three wound treatments

3 讨 论

本研究采用响应面法提取海蜇胶原蛋白，结果表明胶原蛋白最佳提取条件为：提取时间62.64h、液料比23.6:1、醋酸浓度0.562mol/L，在此条件下海蜇胶原蛋白预测得率为1.002%，实际测定值与理论预测值的误差为0.90%。响应面分析法是一种优化工艺条件的有效方法，它以回归方程作为函数估算的工具，确定各因素及其交互作用对各指标的影响，精确地表达因素和响应值之间的关系[17]。因此本研究利用响应面法提取海蜇中的胶原蛋白，结果表明响应面法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

此外本研究还对所提取的胶原蛋白对小鼠伤口模型的促愈合作用进行研究，结果表明胶原蛋白溶液对创面模型伤口愈合有明显的促进作用。本研究采用云南白药作为阳性对照组，云南白药可明显促进小鼠碱性成纤维细胞因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的生成，bFGF与VEGF可促进成纤维细胞与血管内皮细胞生成，因此可以加速血管的生长及结缔组织增生，达到促进伤口愈合的作用。从结果可以看出胶原蛋白组对小鼠伤口的愈合率与云南白药组相比没有显著差异，结果显示胶原蛋白组和云南白药组比正常组伤口要提前2～3d愈合。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广的蛋白质，是细胞外基质的主要成分，能诱导上皮细胞等增殖、分化和移行，且胶原纤维具有弹性，能减少创面的收缩。可以促进成纤维细胞、血管内皮细胞的分化并形成基质。同时胶原蛋白可以促进肉芽组织生长，并为机体修复细胞提供所必需的氨基酸，加速创面的愈合[18]。张红等[18]曾研究胶原蛋白对大鼠创伤皮肤的促愈合作用，结果表明胶原蛋白能加速大鼠创伤模型的愈合率，有效促进大鼠创伤皮肤的愈合。

仇树林等[19]研究表明羟脯氨酸含量的增加，能加速创面的愈合，同时也提高创面的愈合质量。而羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，并是一种具有独特生理活性的氨基酸，它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病等生物活性[20]。

笔者认为胶原蛋白组涂抹了胶原蛋白，增加了羟脯氨酸的含量，从而促进了创面胶原纤维的合成，这可能是胶原蛋白促进伤口愈合的一重要机制；此外胶原蛋白是皮肤细胞外基质的主要成分，细胞外基质加速重建，可为表皮细胞等增殖、分化和移行提供一个合适的微环境，因此这也可能是胶原蛋白促进伤口愈合的一重要环节。但海蜇胶原蛋白的促进伤口愈合详细机理还有待进一步研究。

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Extraction of Collagen from Jellyfish (Rhopilema esculentum) and Wound Healing-Promoting Effect in Mouse

DING Jin-feng，SU Xiu-rong*，ZHANG Chun-dan，LI Yan-yan，XU Jia-jie
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The optimum condition of jellyfish (Rhopilema esculentum Kiahinouye 1891) collagen was studied, and the effect of jellyfish collagen on promoting the wound healing was studied based on the model of mouse skin wounds. Experimental factors and their levels were determined by single-factor tests, and then a three factors and three levels test was designed based on the principle of Box-Benhnken design. The extraction conditions were optimized through response surface method (RSM). In the experiment of wound healing in mouse, cutting-skin injures model in mouse were created and wounds were treated with collagen, at the same time yunnan baiyao was used as positive control. The size of wounds was measured through cross measurement, and the healing rates were calculated. Results showed the optimal conditions of jellyfish collagen extraction were obtained as following: extraction time 62.64 h, the solid/water ratio of 1:23.6, acetic acid concentration of 0.562 mol/L. Animal tests showed that treatment with collagen could significantly accelerate the process of re-epithelialization, and promote wound healing.

jellyfish；collagen；Response surface method (RSM)；wound healing

TS254.4

A

1002-6630(2010)24-0019-05

2010-08-13

浙江省自然科学基金项目(Y304358)；宁波市科技局重点资助项目(200120041)

丁进锋(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为水产品加工与贮藏工程。E-mail：djfeng_0617@163.com

*通信作者：苏秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向为食品科学与工程、生物化学与分子生物学。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn