牛乳中主要过敏原的分离纯化研究进展

蔡小虎，李 欣，陈红兵,*，高金燕

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院食品系，江西 南昌 330047)

牛乳中主要过敏原的分离纯化研究进展

蔡小虎1,2，李 欣1,3，陈红兵1,2,*，高金燕3

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院食品系，江西 南昌 330047)

牛乳中含有3种主要的过敏原蛋白：酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本文详细叙述沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、羟基磷灰石层析法、疏水相互作用层析法、高效液相色谱法以及膜技术等分离纯化技术在牛乳主要过敏原分离纯化中的研究进展。其中，离子交换层析与凝胶层析已被广泛使用，而沉淀法一般作为粗提纯过的步骤。羟基磷灰石层析与疏水相互作用层析法也较为常见，既可单独分离过敏原，又可与其他方法结合来分离过敏原。另外高效液相色谱法与膜技术则是进一步纯化的后续工作，以提高过敏原的纯度。

牛乳过敏；酪蛋白；β-乳球蛋白；α-乳白蛋白；纯化

牛乳是母乳特别重要的替代品，也是新生儿最早接触到的过敏原之一，因而牛乳过敏在婴幼儿中最常见[1]。据调查表明，2%～3%的婴幼儿对牛乳过敏[2]，他们当中大约85%的过敏患者随着年龄的增长到青年时期会产生免疫耐受，而另外15%的患者为终身过敏[3]。牛乳中包含20多种蛋白，这些牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，但目前普遍认为酪蛋白(casein，CN)、β-乳球蛋白(Betalactoglobulin，β-Lg)和α-乳白蛋白(Alpha-lactalbumin， α-La)是主要的过敏原[4-5]。

由于高纯度且具免疫活性的牛乳过敏原是牛乳过敏研究的物质基础，所以随着牛乳过敏研究的深入，分离纯化技术的研究开发也随之变得活跃并得到加强。目前根据牛乳中主要过敏原蛋白质的理化性质，如等电点、配体结合、两亲性质等，采用选择性条件沉淀、色谱分离、超滤以及膜分离等方法已经成功地分离纯化出各种牛乳过敏原，并满足许多研究的要求[6]。

1 牛乳中主要过敏原蛋白的结构及理化性质

1.1 牛乳过敏原组成和理化性质

乳蛋白是乳中最有价值的成分，也含有乳中所有过敏原成分。牛乳中蛋白质含量为3.0%～3.7%，其中主要是酪蛋白(占80%)和乳清蛋白(占20%)，其组成和过敏原主要理化性质见表1[7-8]。

表1 牛乳中蛋白质的化学性质及其过敏原成分Table 1 Chemical characteristics and allergens in milk proteins

1.2 牛乳过敏原特性

1.2.1 酪蛋白

酪蛋白之所以是过敏原，是因为人乳与牛乳酪蛋白的组成和含量不同及其成分结构上的差异。

牛乳中的酪蛋白以酪蛋白胶束状态存在，之后再与磷酸钙形成复合体，称为“酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体”。酪蛋白占牛乳蛋白总量高达80%，酪蛋白不是单一的蛋白质，而是由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4种独立的蛋白组成，还有β-酪蛋白水解得到的3种γ-酪蛋白[9]。

牛乳酪蛋白胶束粒子颗粒大，且沉淀时呈坚硬的凝块，而人乳中的酪蛋白胶束粒子较小，而且沉淀时呈极细微的分散状态。据报道，牛乳酪蛋白的这种凝固性质是其中大量存在的αs-酪蛋白引起的。牛乳酪蛋白中，αs-酪蛋白占60%左右，其中80%是αs1-酪蛋白。而人乳酪蛋白中几乎不含αs-酪蛋白，以β-酪蛋白为主[10]。

αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一个过敏原，凡是对酪蛋白过敏的人，基本上都对αs1-酪蛋白过敏。它是一个含199个氨基酸的单链线性磷酸化蛋白，二级结构比较简单，没有二硫键[11]。

αs2-酪蛋白由207个氨基酸组成，它在所有酪蛋白中亲水性最强，含有11个磷酸化残基，结构中有3簇带负电的磷酸丝氨酸-谷氨酸残基，分别位于8～12、56～63、129～133氨基酸区段[12]。

β-酪蛋白是酪蛋白中过敏原性比较低的一种蛋白质，含有209个氨基酸。虽然β-酪蛋白与αs1-酪蛋白有着较低的同源性，但在结构上有些相似，都是磷酸化蛋白，脯氨酸比较平均分布，缺少二硫键[13]。

κ-酪蛋白分子质量较低，由169个氨基酸构成；与其他酪蛋白不同，它可与碳水化合物结合并且含有二硫键。它是由不同的疏水区和极性区组成的两亲性分子，由于在极性区不包括阴离子磷酸丝氨酸簇，因此不能与钙结合[14]。

尽管αs1-、αs2-、β-、κ-这4种酪蛋白初级结构的相似性很小，但是它们仍有一些结构上的共同特征，从而能使它们明显地区别于其他蛋白，它们都是磷酸化的蛋白，且三级结构易松散[15]。

1.2.2 乳清蛋白

乳清是奶酪及酪蛋白制品的副产品，每升乳清经烘干可得63g乳清粉，其中包括50g的乳糖和6g的蛋白，具有极高的营养价值。牛乳清蛋白中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清中两种主要的蛋白，占乳清蛋白的75%[16]。

因母乳中不含β-乳球蛋白，所以它被认为是最主要的牛乳过敏蛋白，含有162个氨基酸残基，5个二硫键，其中4个为链内，1个为链间。β-乳球蛋白的存在形式与pH值有关，在鲜牛乳中(pH6.6～6.8)，它是以二聚体的形式存在；当pH值低于3.5时二聚体离解成单体，pH值在3.5～5.2 之间时二聚体四聚化形成八聚体；pH值高于7.5时二聚体解离且构象发生变化，形成膨胀的单体，单体的分子质量在18.3kD左右[17]。

牛乳α-乳白蛋白属于溶菌酶家族，分子质量为14.2kD，单体由123个氨基酸残基组成。尽管牛乳α-乳白蛋白与人乳α-乳白蛋白相比有74%的氨基酸残基相同，而且有6%的残基化学性质相似，但α-乳白蛋白仍被认为是一种主要的牛乳过敏原[18-19]。

2 牛乳中主要过敏原分离纯化方法的研究进展

2.1 牛乳中主要过敏原分离纯化方法的分类

目前，牛乳中主要过敏原的分离方法很多，其分类方法也很多，本文主要以下面几点为依据，

对牛乳中主要过敏原的分离纯化方法进行分类：1)根据过敏原溶解度不同，主要是利用过敏原在盐或酸中的溶解度不同，而达到分离的目的，包括盐析沉淀法和等电点沉淀法；2)根据过敏原带电性质不同，利用过敏原在层析柱中带电性不同来分离各种蛋白，包括阴离子交换层析和阳离子交换层析；3)根据选择性吸附不同，主要是根据柱材吸附过敏原的能力不同而使其分

离，包括疏水作用层析和羟基磷灰石层析；4)根据过敏原分子大小不同，利用过敏原的分子质量不同，使一些过敏原易通过，而另一些过敏原不易通过，甚至不能通过，以达到分离纯化目的，包括膜技术和凝胶层析。

2.2 盐析沉淀法

蛋白质在低盐浓度下的溶解度会随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；而当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。在牛乳主要过敏原的分离纯化中常用硫酸铵来粗分离这些过敏蛋白。

Caessens等[20]利用此法分离得到的β-乳球蛋白回收率为68%，纯度为86%。但是，目前此法很少单独使用，常作为一个前处理的步骤来粗提纯过敏原，若要进一步提纯，须与其他方法结合，如离子交换层析和凝胶层析等。

2.3 等电点沉淀法

蛋白质在等电点时溶解度最低，根据牛乳中各种过敏原具有不同的等电点的特点进行分离的方法称为等电点沉淀法。用于提取后去除杂蛋白，通过调节提取液的pH值使某些与待提纯的(目的)蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉出。此法也很少单独使用，常与盐析法结合使用。

张艳等[21]利用在碱性条件下αs-酪蛋白比β-酪蛋白对 Ca2+亲和性更高，以及在酸性pH值和低温下β-酪蛋白可溶而αs-酪蛋白不溶的性质，对αs、β-酪蛋白进行分离纯化，分离得到的αs-酪蛋白组分纯度可达83.33%，β-酪蛋白纯度为109.53%，其回收率分别为48.03%和31.04%。而Alomira等[22]采用调节pH值与盐浓度相结合的方法，从乳清中成功分离了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，所得的纯度分别为90%和95%，回收率分别为89%和69%。

此法既经济又简便，对设备要求不高，分离得到的过敏原纯度满足进一步研究的要求，因此，作为一种较为常用的粗提方法。

2.4 离子交换层析技术

离子交换层析在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛，它是以离子交换剂作为柱填充物，利用不同蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的，它可以分为阴离子交换和阳离子交换两大类，目前已经广泛地应用于过敏原的分离纯化工作中。

Johann等[23]用Source 30Q阴离子交换树脂并且同时采用快速蛋白质液相层析技术，分离纯化酪蛋白中各成分。每1.2g总酪蛋白中可回收456mg αs-酪蛋白和358mg β-酪蛋白，并且还可得到99mg κ-酪蛋白。而El-Sayed等[24]采用阳离子交换色谱分离得到的β-乳球蛋白纯度为95%，回收率为78%，并同时得到纯度为54%的α-乳白蛋白，其回收率为67%。进年来，离子交换层析仍是最为常用的分离纯化牛乳过敏原的方法之一，操作简便，分离效率高，已在实验室中普遍使用。

2.5 疏水作用层析

根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。它是利用蛋白质表面疏水性区域与固定相上疏水性配基相互作用力的差异，将不同蛋白质组分分离开来，与离子交换层析法、亲和层析法相比，该方法在层析过程中蛋白质与固定相的相互作用力较弱，因此蛋白质活性在层析分离过程中不易丧失，更利于过敏原的相关免疫学性质的研究。该技术已成功地被用于过敏原的分离纯化工作。

Bramanti等[25]采用TSK-Gel Ether-5PW疏水色谱柱分离酪蛋白各组分并用BCR-063R鉴定纯度，所分离到αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白纯度分别为76.1%、85.0%、87.9%和65.5%，而且可以在很短的时间内完成，大大提高了分离效率。

2.6 羟基磷灰石层析

羟基磷灰石层析也是分离乳清蛋白主要过敏原的常用方法，它基于羟基磷灰石对一些蛋白质的吸附作用进行分离。羟基磷灰石与生物分子之间通过这些微粒与生物分子中的官能团相互结合，生物分子中官能团的种类、数目、分子空间结构及分子大小不同，则与羟基磷灰石的相互作用不同，洗脱时间也不同，从而把它们分离开来。

Rocco等[26]采用此法分离了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，其纯度分别为84.7%和86.7%，回收率分别为48.3%和32.1%。目前，应用此法，主要是由于其具有以下两点优势：1)低消耗以及使用无毒性材料；2)高回收率和分离产物以自然状态存在。

2.7 超滤和膜技术

超滤浓缩蛋白质是通过外力使蛋白质溶液通过滤膜而仍保留目的蛋白的方法。在静压差为推动力的作用下，原料液中溶剂及小溶质粒子从高压的料液侧被透过膜到低压侧，而原料液中分子质量相对较高的蛋白组分被膜所截留，而水和小的溶质颗粒透过膜的选择性分离过程，从而达到分离、纯化和浓缩的目的。实验室超滤主要是针对小体积蛋白质溶液(几毫升)，用离心力的方法使溶液很容易通过滤膜。

另外，随着科技的进步，膜技术的出现大大提高了乳蛋白的分离效率。它是通过高分子膜的选择透过性，以浓度差梯度、电势梯度作或压力梯度为推动力，在膜相际之间进行传质，以达到不同组分的分离、纯化的目的。

Goodall等[27]利用阴离子交换膜分离出的β-乳球蛋白，并进一步超滤，其纯度高于99%。而Konrad等[28]

也利用超滤膜从乳清中分离出α-乳白蛋白，其纯度达95%。目前而言，膜技术具有显著的经济效益和环保作用，被西方科技界称为21世纪最具发展潜力的高新技术，故其发展相当迅速，应用也越来越广泛。

2.8 凝胶层析

混合蛋白随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因为不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子质量最小的物质可以进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。它是一种简便而快速的分离分析技术，由于设备简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，已在分离牛乳主要过敏原中得到广泛应用。

如Neyestani等[29]用DEAE-C阴离子交换层析和Sephadex G-50凝胶过滤层析分离了β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，纯度均大于95%。另外，蒋红玲等[30]用凝胶过滤层析分离到的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白纯度均大于90%。此法常同一些粗提纯方法结合使用，作为进一步提纯，以获得更高纯度的过敏原。由于此法分离所得过敏原纯度高，设备简单，无须太大投入，目前常与离子交换层析结合，被国内外广泛使用。

2.9 高效液相色谱层析

高效液相色谱层析是一个高效快速分离化合物的方法，由于其速度快、分辨率高、重复性好、灵活性强、适用面广、灵敏度高等特点，使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。它能有效地分离各种多肽混合物，尤其适用于分子质量不大的蛋白质和多肽物质的分离、纯化和鉴定，在牛乳过敏原分离纯化中已成功地得到应用。

王娟等[31]用反向高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography，RE-HLPC)分离到的各过敏原蛋白回收率均相当可观，其中αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白的回收率分别为94.3%、83.3%、91.9%和80.7%，乳清的回收率为91.8%，其纯度均在99%以上。而Schlatterer等[32]利用反向高效液相色谱分离到的β-乳球蛋白纯度大约99%，回收率为55%。

3 结 语

牛乳虽然有极高的营养价值，但其过敏源性也不容忽视。开展牛乳主要过敏原的研究有重大意义，解决好这些过敏原的分离技术成为其开发利用的重要一环。目前，关于牛乳主要过敏原分离纯化的技术虽然很多，但仍有两点问题需要考虑：1)一些纯化方法的回收率及纯度不是很高，但操作简便，对设备要求不高，而一些方法虽然回收率和纯度高，但成本却较贵，因此，从生产成本和经济效益来看，有待于进一步研究；2)在牛乳过敏原的分离纯化中，往往使用一种方法不能达到分离效果，因此需要同时采用两种或多种不同的分离纯化方法，起到提取高纯度过敏原的目的。

因此，牛乳主要过敏原的分离纯化技术有待于进一步研究，而同时采用多种提纯方法纯化过敏原也将成为今后的主要发展趋势，并且，随着人类对牛乳过敏的越来越重视，牛乳过敏原的分离纯化技术也将得到更深入的研究，使其既经济又有效的分离纯化牛乳中各主要过敏原。

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Research Progress in Isolation and Purification of Major Allergens from Bovine Milk

CAI Xiao-hu1,2，LI Xin1,3，CHEN Hong-bing1,2,*，GAO Jin-yan3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Department of Food Science, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The bovine milk contains three kinds of major allergen proteins such as casein, β-lactoglobulin and α-lactalbumin. This article has reviewed research progresses on purification methods of major milk allergens. The purification methods including precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapatite chromatography, hydrophobic interaction chromatography, high performance liquid chromatography and membrane technology have been discussed. Among them, ion exchange chromatography and gel filtration have been used widely, and precipitation method has been generally used in the rough purification step. Although hydroxyapatite chromatography and hydrophobic interaction chromatography are also common for the purification, they can not be used to isolate allergens individually and need to combine with other methods for the separation of allergens. High performance liquid chromatography and membrane technology are suitable for the follow-up purification to improve the purity of allergens.

milk allergen； casein；β-lactoglobulin；α-lactalbumin；purification

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0429-05

2010-08-11

教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目(NCET-08-07-04)；国家自然科学基金项目(0860220)；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200807)；江西省青年科学基金项目(2009GQN0089)

蔡小虎(1986-)，男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：cxhglamour@163.com

*通信作者：陈红兵(1967-)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com