一种水溶性苝系衍生物pH荧光探针的合成及表征

马永山,吴俊森,常乃丰，孙韶华

（1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101）（2.济南市供排水监测中心，山东济南250033）

0 引言

荧光pH探针是分子探针的一种，广泛应用于分析化学、生物分析化学、医学(监控血液中的pH)和细胞生物学(量度细胞内的pH)等领域[1]。根据涉及到的基本过程，大多数荧光pH探针发生作用的机制有两类：一类是光诱导电子迁移过程(简称PET)，另一类是光诱导电荷迁移过程(简称PCT)[2]。这两类作用机制都是通过质子化[3]、氢键[4～5]、以及氢质子与荧光染料的过渡态形成不稳定化学键来实现的[6]。带有羧基的苝酰亚胺型荧光染料具有显著的优点：既有亲脂性又有亲水性(苝骨架使其具备亲脂性，羧基的存在又使其兼具亲水性)，斯托克斯位移大且荧光量子产率高。既有亲脂性又有亲水性使其能渗透到细胞内，可用于活体组织内pH的测定；斯托克斯位移较大可避免吸收光谱干扰发射光谱，从而提高测试的灵敏度与准确性。因此将带有胺基的苝酰亚胺类荧光染料开发作为pH荧光探针具有重要的应用价值和广阔的发展前景。苝二酰亚胺衍生物的合成方法早已有报道[7～8]，该文参考有关文献自行设计合成了含有四个羧基亲水性基团的苝二酰亚胺衍生物，并首次研究了它作为pH荧光探针的光谱特性，光谱变化表明：它随溶液pH的减小荧光强度逐渐降低，可作为pH荧光探针。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

天冬氨酸、氢氧化钾、二甲基亚砜、浓硫酸、无水乙醇、盐酸、3,4;9,10-苝四甲酸二酐均为分析纯试剂。

1HNMR谱用Varian Inova 400 MHz NMR spectrometer；布鲁克TENSOR27型傅里叶变换红外光谱仪；CARY50紫外可见分光光度计；日立F-4500型荧光分光光度计；精密pH计PHS-3C(上海雷磁仪器厂)。

1.2 合成(合成路线如图1所示)

1.2.1 苝二（天冬氨酸）二酰亚胺的合成[7～8]

准确称取1.33 g（0.01 mol）天冬氨酸与1.12 g（0.02 mol）KOH的水溶液混合、室温搅拌过夜，减压旋转蒸除体系水分，得2.1 g天冬氨酸钾盐晶体。将制备的天冬氨酸钾盐超声分散在40 mL DMSO溶液中后，在磁力搅拌下使其回流半小时，再加入0.4 g精制的苝酐继续搅拌、回流，每隔30 min取少量样品在浓硫酸中测可见光谱，直到在500 nm、546 nm左右苝酐的特征吸收峰消失，而在560 nm、600 nm左右出现对称苝四羧酸二酰亚胺的特征峰，且两者的相对强度基本不变时停止反应。将反应后体系离心，沉淀用无水乙醇洗至滤液基本无色，加水用稀盐酸酸化至pH=1，水洗3次，得到化合物2。

1.2.2 苝二（天冬氨酸铵盐）二酰亚胺的合成

将化合物2溶解到20 mL 15%的氨水里面，搅拌5 min，过滤得滤液，除掉溶剂得到红棕色的固体，80℃真空干燥得0.45g产物3，产率约70%。1H-NMR(D2O,TMS,ppm)δ:7.37(d,4H),7.00(d,4H),5.26(m,2H),2.12(s,4H);FTIR(KBr)，ν/cm-1:3 433,3 164(酰胺N-H伸缩振动),3 052(苝环C-H伸缩振动),2 847（饱和C-H伸缩振动），1 689(羧酸C=O伸缩振动),1 592(苝环C=C)，1 361,1 345(C-N),1 273,1 182,1 114,1 021,951(羧酸中C-O),853,809,793,737,659,461,432(C-H非平面摇摆);m/z=616[M]+。

图1 化合物3的合成路线Fig.1 Synthesis route of compound 3

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

图2 10-5mol/L的化合物3水溶液的不同pH值的荧光图（λmax=551 nm）（2×10-3mol/L的磷酸缓冲体系，内置图为化合物3最大荧光强度值与pH值的对应图）Fig.2 The fluorescence spectra of compound 3(10-5mol/L)in water at different pH(2×10-3mol/L phosphate buffer;Insert is the relative fluorescence intensity change of compound 3 at different pH)

图2为10-5mol/L的化合物3荧光强度随pH变化的曲线图，右上角内置图为荧光强度随pH值变化的改变趋势图。化合物3的最大发射波长为λmax=551 nm，伴随溶液pH值降低，荧光发射强度逐渐降低。在pH值由10.75降到9.66时，荧光强度急剧降低，在碱性溶液中化合物3以羧酸根的形式存在，羧酸根阴离子为富电子特征，使整个化合物分子具有较高的电子密度，苝核平面之间存在的斥力阻止了它们的聚集从而获得高的荧光量子产率；溶液pH从9.66降到5.12时，荧光强度降低缓慢，体系为苝四羧酸及其盐的缓冲溶液，发光物种比较稳定，荧光强度降低幅度不大；当pH值降低到5.12以下，荧光强度迅速降低直至淬灭，峰形也发生了改变，在强酸性溶液中，化合物3主要以酸式形势存在，整个化合物分子负电势减弱，苝分子间发生聚集作用和光诱导电子转移现象使荧光萃灭。这说明化合物3的荧光强度与pH值间有着强烈的依赖关系，在强碱性溶液中荧光强度最强，在较宽的中性区域环境溶液中荧光较弱且稳定，而在强酸性溶液中荧光被萃灭，此化合物可用作测定溶液pH值的荧光探针。

2.2 UV-vis吸收光谱

化合物3的最大吸收波长为534 nm。伴随pH值减小，吸收峰强度减小。对于苝系衍生物来说，电子振动吸收具有自身的特点，υ=0→υ'=0,1和2的跃迁（这里的υ和υ'是基态和激发态的量子振动数）分别对应着534 nm、500 nm和465 nm处吸收峰，当单体开始聚集时，0→1和0→2跃迁会增加[9～10]，为利于比较0→1和0→2峰形变化，在534 nm处将峰值做归一化处理（图3）。从pH 10.75到9.66，0→1和0→2跃迁吸收有所增加，说明在这个pH范围苝四羧酸根单体因发生π-π作用而聚集；从9.66到5.92，0→1和0→2跃迁吸收有微弱增加，说明在这个pH范围的π-π聚集作用的大小变化较弱；而当pH继续降低到5.12甚至是更低的时候，0→1和0→0跃迁吸收的比率明显的增大，初始的吸收峰发生红移，最终在整个检测波段内出现吸收，这是因为伴随pH值降低，化合物3的苝四羧酸单体发生π-π作用而聚集，从而阻止了光的通过，化合物3的紫外可见吸收光谱印证了荧光强度与pH值之间效应的机理。

3 结论

合成了一种水溶性的荧光化合物：对称苝二（天冬氨酸铵盐）二酰亚胺化合物。研究了pH值变化对荧光光谱的影响，发现所研究化合物的荧光强度与pH值间有着强烈的依赖关系，在强碱性溶液中荧光强度最强，在较宽的中性区域环境溶液中荧光较弱，而在强酸性溶液中荧光被萃灭。这一结果对于深入研究苝二酰亚胺衍生物的基础光物理性质和pH荧光传感体系的设计具有理论和应用意义。

图3 归一化的10-5mol/L化合物3的水溶液的吸收光谱与pH值的对应图（pH：4.73，5.12，5.92，6.78，7.81，9.66，9.87，10.08，10.75）Fig.3 The normalized absorption spectra of compound 3(10-5mol/L)in water at different pH（pH：4.73，5.12，5.92，6.78，7.81，9.66，9.87，10.08，10.75）

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