基于纳米粒子吸附的甲基对硫磷传感器研究

刘淑娟，谭正初，钟兴刚,2

（1.湖南省农科院茶叶研究所,湖南长沙410125）（2.湖南省茶叶检测中心,湖南长沙410125）

0 引言

由于人们在防治病虫害过程中不合理和超剂量使用化学农药，导致了粮食、蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留问题，不仅影响了农产品的品质，也危害人类的健康。传统上有机磷农药分析方法主要是利用气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱以及各种光谱联用技术[1]。虽然这些方法的选择性、灵敏度和准确度高，但需要昂贵的仪器设备，样品的前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场检测。而且仪器分析法多为检测干物质中的农残含量，不能准确反映人体实际摄入的农残含量。

与传统分析技术相比，有机磷传感器快速检测法具有简单、快速、灵敏、低成本和便于携带等优点[2～5]。国内外关于利用胆碱酯酶和有机磷水解酶检测有机磷的文献已有报道，如Albareda等[6]用乙酰胆碱酯酶直接检测自来水和果汁样品中的对氧磷和敌百威。Josiane等[7]用乙酰胆碱酯酶传感器测定西红柿中的西维因，并与高效液相色谱法比较，取得较好的分析结果。Suprun等[8]用传感器对涕灭威、对氧磷和甲基对硫磷等3种农药残留进行检测，检出限分别为30、10和5 μg/mL。但酶传感技术因其成本高，酶分子易失活、不易再生等缺点，应用起来有一定的局限性。

研究表明，纳米粒子具有特殊的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，以及由此产生的许多光学和电学性质[9]。一些纳米材料，例如纳米Au[10]、纳米Ag[11]、纳米TiO2[12]、纳米ZrO2[13]、纳米Al2O3[14]等具有良好的生物相容性，将其运用到生物传感器中，可提供生物材料适宜的微环境，达到维持生物组分活性、改进生物传感器性能的目的。研究纳米粒子在生物分子固定中的应用对于开发高性能、具有特殊功能的复合材料具有十分重要的意义。ZrO2是一种无毒性的无机氧化物材料，具有热稳定性、化学惰性和良好的生物兼容性[15～16]。制备ZrO2粒子的方法已有报道，ZrO2粒子作为一种多功能的无机材料已得到较为广泛的应用[17～21]。

该文将ZrO2纳米粒子用于有机磷传感器的构造，大大提高了传感器的响应性能。先在金面上电沉积一层ZrO2纳米粒子，然后将此电极浸入一定浓度的有机磷溶液中进行吸附，根据对应电极的方波溶出伏安法峰电流的大小来实现溶液中有机磷的定量检测（图1）。实验结果表明，以ZrO2纳米粒子吸附有机磷制成的甲基对硫磷传感器构造简单，克服了酶传感器不稳定、酶分子易失活等缺点，降低了传感器的构建成本，传感界面对甲基对硫磷的检出限低，重现性和稳定性好，而且电极检测速度快，操作简便，使用寿命较长，可直接用于茶汤中有机磷农残的快速检测。此外，传感器可以再生反复使用，再生过程简单。

图1 有机磷传感器构建原理图Fig.1 Scheme of Ops electrochemical sensor

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI760b电化学工作站购于中国上海辰华仪器厂，金电极（直径为3 mm）购于上海辰华仪器厂，电化学反应池为三电极系统，其中修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。ZrOCl2·8H2O购于广东省汕头市光华试剂厂；其它试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。

1.2 传感器的制备

参照文献[22]的方法，金电极在使用前分别用0.3 μm和0.05 μm的铝粉抛光至镜面，并依次在6 mol/L HNO3、丙酮和二次蒸馏水中各超声洗涤2 min，水洗并用氮气吹干。实验开始前，把清洗过的电极置于0.2 mol/L硫酸中，在0.5～1.5 V的电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，水洗吹干备用。然后将处理好的金电极放入含5.0 mmol/L ZrOCl2的0.1 mol/L KCl溶液中，在-1.1～0.7 V之间以20 mV/s的速率扫描十个循环。取出水洗并用氮气吹干。

1.3 样品前处理

取茶叶样品3 g用150 mL 0.1 mol/L KCl（90℃,pH7.0）溶液浸泡10 min后过滤冷却即可用于测量。

1.4 检测方法

将ZrO2/Au电极浸入含一定浓度有机磷农药的0.1 mol/L KCl溶液中轻微搅拌2 min，用去离子水洗涤，置于含10 mL 0.1 mol/L KCl溶液的小烧杯中。在开始测量前，该KCl溶液通氮气5 min以除去溶液中的氧。在电压-0.4～0.3 V之间进行方波伏安（SWV）测量，电位增量为4 mV，频率为25 Hz。用CHI660软件作基线校正。所有试验均在室温下进行。

1.5 传感器的再生

将传感器进行多次SWV扫描可使吸附的有机磷洗脱，然后电极用去离子水和缓冲液清洗，就可进行下一次的测定。

2 结果与讨论

2.1 电沉积循环伏安图

在文中，将金电极置于5.0 mmol/L ZrOCl2和0.5 mol/L KCl混合溶液中，通过电化学扫描实现ZrO2纳米粒子在金电极上的沉积。图2显示了在金电极上ZrO2纳米颗粒电沉积的循环伏安图。实验中所用的电压范围是-1.1～0.7 V，扫描速率是20 mV/s，一共扫描十个循环。阴极和阳极电流在-0.6到-1.1 V电压范围内的显著变化反映金面上发生了复杂的氧化还原反应[17]。从图中可看出，从第一轮到第十轮循环，还原峰逐渐变弱，峰电流逐渐减小。推测阴极电流的减小是因为金面上ZrO2薄层膜的形成阻碍了氧化还原反应的进程引起的。金电极表面ZrO2纳米颗粒为有机磷的固定提供了一个较大的有效表面积，有利于有机磷在其表面的吸附，提高传感器的响应性能。

图2 金电极在0.5 mol/L KCl溶液中(a)及金电极在5.0 mmol/L ZrOCl2和0.5 mol/L KCl混合溶液中(b)的循环伏安图Fig.2 The cyclic voltammograms of the cleaned gold electrode in 0.5 mol/L KCl(a)and in 5.0 mmol/L ZrOCl2 and 0.5 mol/L KCl(b),scan rate 20 mV/s

2.2 传感器工作原理

该文采用金电极表面电沉积二氧化锆纳米粒子制成了OPs/ZrO2粒子层/金电极电流型生物传感器。在吸附氨基甲酸酯和有机磷物质后，该传感器在0.1 mol/L KCl溶液中做SWV扫描，在扫描电位0.093 V会有一个SWV溶出峰，根据溶出峰电流的大小可实现溶液中有机磷的定量检测。将组装好的电极浸入一定浓度有机磷溶液进行吸附后，将OPs/ZrO2/Au电极在10 mL 0.1 mol/L KCl进行溶出伏安扫描，参考文献[22]用Sigmaplot软件对其进行基线校正处理，得出相应的溶出伏安图（图3），根据溶出峰电流的大小可计算有机磷的浓度。ZrO2纳米粒子对磷酸基团有很强的吸附能力，在电极上电沉积的ZrO2纳米粒子层有效地扩大了电极的表面积，大大增加了电极表面有机磷的吸附量（图4）。

图3 传感器在0.1 mol/L KCl溶液中的溶出伏安图，插图为基线校正后的曲线Fig.3 Stripping voltammograms of the biosensor in 0.1 mol/L KCl,inset is corresponding calibration curve

图4 传感器在500 ng/mL甲基对硫磷溶液中吸附后的溶出伏安图(a:裸金电极；b:ZrO2/Au电极)Fig.4 Stripping voltammograms of the biosensor after adsorption in 500 ng/mL parathion-methyl(a:bare gold electrode；b:ZrO2/Au)

2.3 实验条件的选择

2.3.1 缓冲溶液pH值的选择

实验用1.0 mol/L的NaOH和HCl对待测有机磷溶液的pH值进行调节，考察了溶液pH值对响应信号的影响。在其它条件相同的前提下，不同pH值对溶出峰电流的影响如图5所示。结果表明，在pH7.0的0.1 mol/L KCl溶液中，传感器的SWV响应电流较大。故实验中选择pH值为7.0的0.1 mol/L KCl溶液为支持电解质。

图5 溶液pH值对传感器响应性能的影响（甲基对硫磷浓度：500 ng/mL；扫描电压：-0.4～0.3 V；频率25 Hz；电位增量4 mV）Fig.5 Effect of pH of adsorption medium on the adsorption of parathion-methyl(the concentration of parathionmethyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;frequency:25 Hz;increasing potential:4 mV）

2.3.2 有机磷吸附方法及吸附时间的选择

实验对比了有机磷在电极上的吸附方法，通过在电极表面滴加有机磷溶液和把电极置于有机磷溶液中搅拌两种方法吸附有机磷进行对比，结果表明，把电极浸入有机磷溶液中慢速搅拌2 min既能获得较大的SWV响应电流，又能使电极保持稳定。

2.3.3 电化学参数的选择

进行电化学检测时，不同方波频率的传感器SWV响应电流如图6所示，首先，随着方波频率的增大，峰电流变大，当方波频率达到25 Hz时，SWV响应电流最大，之后峰电流随方波频率的增加而逐渐变小。不同电位增量的SWV响应电流选择如图7所示，当电位增量为4 mV时，峰电流最大，且此时峰形较好。电位增量增至4 mV以后电流逐渐减小，峰变得不对称，峰形变差。实验表明，以方波频率25 Hz，电位增量为4 mV时的峰电流最大，峰形较好。

图6 方波频率对传感器响应性能的影响（甲基对硫磷浓度：500 ng/mL；扫描电压：-0.4～0.3 V；pH：7.0；电位增量：4 mV）Fig.6 Effect of square wave frequency to the biosensor(the concentration of parathion-methyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;pH:7.0;increasing potential:4 mV）

图7 电位增量对传感器响应性能的影响（甲基对硫磷浓度：500 ng/mL；扫描电压：-0.4～0.3 V；pH：7.0；方波频率：25 Hz）Fig.7 Effect of increasing potential to the biosensor(the concentration of parathion-methyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;pH:7.0;square wave frequency:25 Hz）

2.4 传感器的工作曲线

图8是传感器在上述所选择的最佳工作条件下吸附不同浓度甲基对硫磷后所做得的SWV图，由图8可知，在一定浓度范围内，随着吸附有机磷浓度的增大，SWV溶出峰电流也相应增大。以甲基对硫磷浓度为横坐标，对应的方波溶出伏安法峰电流为纵坐标做图，得传感器工作曲线如图9所示。由图可知，SWV与甲基对硫磷浓度在10～500 ng/mL范围内成线性关系，其回归方程为：y=0.232 3x+1.202,线性相关系数r为0.995 3。用同种方法制得的5支ZrO2/Au电极测定10份相同农药样品（200 ng/mL），测得的相对标准偏差为5.2%。以3倍空白值的标准偏差相对应的浓度称为检出限，计算得该甲基对硫磷传感器的检出限为2.0 ng/mL。

图8 不同浓度甲基对硫磷的溶出伏安图（扫描电压：-0.4～0.3 V；频率25 Hz；电位增量4 mV）Fig.8 Stripping voltammograms of parathion-methyl concentration(scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;frequency:25 Hz;increasing potential:4 mV)

图9 有机磷传感器的工作曲线Fig.9 The calibration curve of parathion-methyl

2.5 传感器的重现性和稳定性

将制好的甲基对硫磷传感器在相同条件下对甲基对硫磷溶液（浓度为100 ng/mL）重复测定10次，相对标准偏差为3.9%；将同批次制备的5支甲基对硫磷传感器在相同条件下测定，相对标准偏差为4.2%，说明重现性良好。将制备好的有机磷传感器浸在pH7.0的磷酸缓冲液中并置于4℃冰箱中保存，测定传感器放置后对甲基对硫磷的响应性能，结果表明，传感器放置2周后传感器对甲基对硫磷的响应没有明显改变，放置一个月后电极仍能保持原有响应的87%。

2.6 传感器的再生

在与工作曲线相同的电化学参数下，将OPs/ZrO2/Au电极进行连续多次SWV扫描，随着扫描次数的增加，SWV溶出峰越来越小，在连续十次扫描后，电极上吸附的OPs几乎全部被溶出，电极可继续用于下次测量。

2.7 非特异性试验

实验对传感器在磷酸根离子、硫酸根离子及硝酸根离子等无机离子存在下的OPs溶液（100 ng/mL）的电流响应进行了考察，在这类离子存在下，电流响应无明显变化；实验还对氯氰菊酯、六六六、三氯杀螨醇等有机氯和菊酯类农药存在时传感器的电流响应进行了考察，这类农药残留对传感器的电流响应也无明显影响。结果表明传感器的特异性较好，可直接用于茶汤中有机磷农残的检测。

2.8 初步应用

2.8.1 准确性实验

为了考察实际应用的可能性，用该传感器检测了5个不同待测茶叶样品添加甲基对硫磷溶液后的回收率。先对按2.3所述处理的茶汤样品进行浓度测定，然后在各样品中加入已知量的甲基对硫磷溶液，再以同样方法对添加后的样品进行测定，得到的检测结果见表1，在5个不同浓度的茶汤样品中添加甲基对硫磷，得到的平均回收率在94.27%至107.2%之间，表明试验结果较为准确。

表1 添加回收率试验Tab.1 Detection results of samples of parathion-methyl in tea samples

2.8.2 传感器工作效率及成本分析

该传感器直接在金电极上组装二氧化锆纳米粒子，直接进行有机磷类农药残留的检测，传感器组装过程所用的无机材料价格低廉，测定过程简单。该传感器的构建过程可在1 h内完成，每测一个茶叶样品所用的时间仅需几分钟，传感器的工作效率高。

3 结论

针对目前茶叶有机磷分析方法的现状和不足，提出了一种在金电极面上电沉积二氧化锆纳米粒子以吸附有机磷和氨基甲酸酯类农药的电流型传感器，以实现对茶汤中有机磷农药残留的定量检测。该传感器制作成本低廉，操作方便，灵敏度高，是一种简单快速测定茶叶中有机磷农残的新方法。

致谢：部分实验在湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室完成，得到了沈国励教授、郭慢丽老师等人的热情相助，在此深表谢意

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