阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化的保护作用

张国欣 薛兰芬 聂丽敏 王蕾 潘志兰 许静

肾间质纤维化是多种肾脏疾病的共同特征，是进展至终末期肾病的共同通路［1］。本实验通过单侧输尿管结扎术建立肾间质纤维化动物模型，并进行药物干预，通过免疫组织化学、病理组织学检查等方法检查肝细胞生长因子(HGF)在肾小管间质的表达情况及用药后的变化，进一步了解他汀类药物的肾保护作用机制，为肾间质纤维化的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 阿托伐他汀钙片(立普妥，进口注册证号:H2030119，10 mg/片，Godeck GmbH生产，辉瑞制药有限公司分装)。兔抗大鼠HGF多克隆抗体。SP免疫组化试剂盒。以上均购自北京中山生物技术有限公司。

1．2 实验方法

1．2．1 实验动物与分组:清洁级健康雄性 Wistar大鼠54只(购自河北医科大学动物实验中心)，体重180～220 g。适应性饲养1周后，随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、阿托伐他汀治疗组(C组)，每组18只。每组又因于术后第3、7、14天分批处死而分为N3、N7、N14组，每组6只。

1．2．2 动物模型建立:术前空腹12 h，予 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)经腹腔注射麻醉后。下腹正中切口2．5 cm暴露左侧肾脏，分离左侧输尿管，于中上1/3处结扎并剪断，使左肾完全梗阻，后逐层缝合。A组开腹后只游离输尿管，不结扎。

1．2．3 给药方法:于术前3 d开始灌胃。C组给予阿托伐他汀(10 mg·kg－1·d－1，溶于 0．9% 氯化钠溶液，制成混悬液)，A组及B组给予等量0．9%氯化钠溶液灌胃。实验期间大鼠自由进食水。

1．2．4 标本收集与制备:分别于术后第3、7、14天断头处死。留取血标本2 ml，检测血清总胆固醇(TC)。迅速切取左肾，去除包膜，按冠状位纵行剖开，置于10%中性甲醛中固定。48 h后行石蜡包埋，将肾组织切成5μm切片，行HE、Masson及免疫组织化学染色。

1．2．5 生化检查:血标本采用日本Olympus AU-2700全自动生化分析仪测定血TC。

1．3 病理检查

1．3．1 组织固定、脱水、渗蜡、包埋:组织块置于10%中性甲醛中，固定48 h，不同浓度的乙醇梯度脱水各2 h，其中95%2次，无水乙醇脱水3次，各30 min。二甲苯脱乙醇3次，各30 min。石蜡浸入3次，分别为30 min、30 min、1 h。石蜡冷却包埋。

1．3．2 载玻片的处理:载玻片经硫酸洗液浸泡24 h以上，95%乙醇浸泡24 h，蒸馏水洗3～5次，将载玻片整齐排好，在烤箱中烤干。用纯丙酮以1:150稀释粘合剂 APES，将载玻片浸入其中1～2 min，取出低温(37℃)烤干。

1．3．3 切片:应用切片机，厚度为5μm，切片后于37℃恒温箱中过夜。

1．3．4 石蜡切片脱蜡至水:二甲苯脱石蜡2次，各15 min，无水乙醇浸入2次，各10min，95%、80%、70%、60%、50%乙醇浸入各2 min，自来水、蒸馏水反复冲洗。

1．3．5 HE染色:脱蜡至水的切片浸入苏木素3 min，水洗。1%盐酸乙醇分化片刻，水洗。1%氨水溶液蓝化片刻，水洗。0．5%伊红乙醇浸染3 min。70%乙醇1 min，取出甩干，80%乙醇1min，取出甩干，95%乙醇1 min，3个无水乙醇各2 min，3个二甲苯各2 min。最后树胶封片。

1．3．6 Masson染色:切片常规脱蜡至水(同HE染色)，置于丽春红染液2 min，入2%冰醋酸水溶液2 min，入5%磷钼酸水溶液煤染2 min，再入2%冰醋酸水溶液2 min，甲基绿染色3 min，自来水冲洗。95%乙醇分色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

绿色为胶原纤维，在高倍镜(×200)下随即选择15个不含肾小球及血管的肾皮质视野，以肾间质面积占一个视野场面积的百分比作为相对间质容积值。

1．3．7 免疫组织化学染色(采用SP法):①5μm石蜡切片常规脱蜡至水(同HE染色)。②新鲜配置的3%H2O2孵育10～15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。③蒸馏水冲洗3次，画蜡边。④抗原修复，采用水煮法。切片放入盛有抗原修复液(0．1 mol/L 的 PBS，pH 值 7．2 ～7．4)的小烧杯中，并将烧杯置于盛有自来水的大烧杯中，电炉上加热煮沸。从小烧杯的温度到达98～99℃起开始计时20 min。⑤用1%BSA(小牛血清白蛋白)封闭，室温孵育10～15 min(封闭组织内电荷)，倾去血清，勿洗。⑥滴加1/50稀释的一抗，4℃过夜。⑦PBS冲洗5 min，3遍。⑧滴加生物素标记的二抗，37℃孵育60 min。⑨PBS冲洗 5 min，3遍。⑩滴加 SP复合物，37℃孵育 30～40 min。〇11PBS 冲洗 5 min，3 遍。〇12显色:PBS 4 m l、DAB 5 g、H2O25μl，显色5 min左右(以镜下适度为好)。〇13自来水冲洗5次。〇14苏木素复染1 min，水洗，1%盐酸酒精分化，脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

采用1%BSA代替一抗的组织切片作为阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照。光镜下阳性反应部位为棕黄色。应用真彩色医学图像分析系统通过光学显微镜摄入图像，放大200倍，每例切片随机选取15个不含肾小球和小血管的肾皮质视野，测定阳性着色部位的总积分光密度值，并取其平均值为肾小管间质 ICAM-1、P-选择素、NF-κB、ColⅢ表达的阳性面积与着色强度综合评价指标。

1．4 统计学分析应用SPSS10．0统计软件，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，对数据进行相关分析并对相关系数r进行显著性t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 TC的变化 C组单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠在阿托伐他汀的干预下，TC的变化与A组及B组比较差异均无统计学意义(P ＞0．05)。见表1。

表1 3组总胆固醇水平比较n=6，mmol/L，±s

表1 3组总胆固醇水平比较n=6，mmol/L，±s

时间 A组 B组 C组2．1 ±0．3 2．1 ±0．4 2．3 ±0．3术后第7 天 2．1 ±0．3 2．1 ±0．5 2．1 ±0．2术后第14天术后第3天2．1 ±0．5 2．1 ±0．3 2．2 ±0．5

2．2 肾组织形态学改变 经HE、Masson染色，光镜下观察A组从第3天到第14天肾组织未见明显病理改变。B组术后第3天开始出现肾间质水肿、单核细胞浸润，远端肾小管上皮细胞扁平、肾间质增宽的特征，肾小球未见明显异常;术后第7天肾小管明显扩张，肾间质大量炎性细胞浸润，管腔内可见脱落的上皮细胞，偶见萎缩的肾小管;术后第14天梗阻侧肾脏肉眼观察:肾脏体积增大，颜色灰白，内有浑浊的尿液，肾皮质变薄，光镜下可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩，小管基底膜不同程度断裂，皮质及外髓萎缩的肾小管较多，间质中大量淋巴单核细胞浸润，纤维化明显，偶见肾小球硬化。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻，肾间质相对面积明显减少(P＜0．05)。3组比较差异有统计学意义(P ＜0．05)。见表2。

表2 3组肾间质纤维化结果半定量分析n=6，±s

表2 3组肾间质纤维化结果半定量分析n=6，±s

注:与A组比较，*P ＜0．05;与术后3 d比较，#P ＜0．05;与B组比较，△P＜0．05

组别 术后第3天 术后第7天 术后第14天A组0．020 ±0．003 0．021 ±0．005 0．023 ±0．004 B 组 0．323 ±0．014* 0．520 ±0．080*# 0．662 ±0．021*#C 组 0．276 ±0．006＊△ 0．380 ±0．005＊△ 0．455 ±0．004＊△

2．3 免疫组化结果 HGF在肾小管间质A组各时期均几乎无表达。在B组、C组主要表达于肾小管上皮细胞，肾间质有少量表达，3 d时HGF表达较正常轻度增高，7 d时表达至高峰，14 d时表达减少(P＜0．05)。C组与B组同时相点比较，HGF的表达均增高，组间、组内差异均有统计学意义(P＜0．05)。见表 3。

表3 3组HGF免疫组化结果n=6±s

表3 3组HGF免疫组化结果n=6±s

注:与A组比较，*P ＜0．05;与术后3 d比较，#P ＜0．05;与B组比较，△P ＜0．05

组别 术后第3天 术后第7天 术后第14天A组29±5 26±9 30±7 B组 42±10* 125±7＊△ 35±8＊△C组 51±10*# 144±13*# 52±6*#

3 讨论

近年来他汀类药物的非依赖降脂的肾保护作用被不断发现，Yamasthita等［2］研究表明，西立伐他汀通过抑制肾纤维化，降低尿蛋白来延缓由高血压诱导的肾损害。Jandeleit-Dahm等［3］给予5/6肾切除大鼠阿托伐他汀治疗12周，在未影响血脂和肾功能的情况下，发现大鼠尿蛋白减少，肾组织中TGF-β基因表达下调，肾小球及肾小管中单核巨噬细胞浸润减轻。

肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病发展的共同结局。大量形态学定量分析认为它是决定预后的重要因素，其病理过程起初是炎症期，以淋巴、单核细胞为主的炎细胞浸润，肾小管变性损伤，继而肾间质中的成纤维细胞活化，产生大量基质蛋白，间质纤维化［4］。HGF作为近期研究最热的抑制纤维化因子，在肾脏中作用靶点较多，其可与TGF-β1的互逆作用，进而达到抑制肾小管上皮细胞转分化(EMT)［5］。本实验即采用UUO大鼠造成肾间质纤维化，模拟人体内的纤维化过程，研究阿托伐他丁对肾脏的保护作用。UUO术后第3天，肾小管开始扩张，即可观察到HGF表达增加术后第7天，肾小管明显扩张，HGF表达明显增加到术后第14天，HGF表达均明显下降，并伴有细胞外基质(ECM)大量沉积，肾小管萎缩，刷状缘脱落，而肾小球基本未受影响。治疗组较对照组HGF表达增强。

本实验研究结果表明HGF在肾间质纤维化的发生、发展中起着重要的作用。在UUO模型中HGF表达显著增高，抑制了肾间质纤维化，阿托伐他汀促进了HGF的高表达，减轻肾间质炎性细胞浸润及肾间质纤维化，对肾脏有一定的保护作用。阿托伐他汀对HGF的抑制作用是独立于降脂之外的。

1 Wynn TA．Cellular and molecularmechanisms of fibrosis．The Journal of Pathology，2007，214:199-210．

2 Yamashita T，Kawashima S，Miwa Y，et al．A 3-hydroxy-3-methylglutarylco-enzyme A reductase inhibitor reduces hypertensive nephrosclerosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats．JHypertens，2002，20:2465-2473．

3 Jandeleit-Dahm K，Cao Z，Cox AJ，et al．Role of hyperlipidemia in progressive renal disease:focus on diabetic nephropathy．Kidney Int，1999，56(Suppl 71):S31-64．

4 Yang L，Liu Y．Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis．JAm Soc Nephrol，2002，13:96-107．

5 郭华，邹万忠．肾小管间质纤维化与单核巨噬细胞的关系．北京大学学报，2003，35:503-507．